Métodos diagnósticos

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GENÉTICA MÉDICA
Julya Pavão
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
· Hibridização fluorescente in situ (FISH):
· Sonda: sequência complementar a um segmento de DNA conhecido;
· A sonda se hibridiza com a sequência de DNA do segmento cromossômico estudado;
· A sonda tem componentes fluorescentes: a região onde ocorreu a hibridização é visualizada pelo microscópio de fluorescência. 
· Áreas de abrangência: 
· Onco-hematologia: identificação, rastreamento e monitoramento das anormalidades cromossômicas. 
· Genética constitucional: síndromes genéticas específicas. 
· Diagnóstico pré-natal: aneuploidias cromossômicas. 
· Etapas: 
· Sonda de DNA marcada com corante fluorescente;
· Desnaturação do DNA;
· Hibridização da sonda com o DNA;
· Multiplicação gênica; 
· Análise da fluorescência no microscópio ( + = ocorreu hibridização, - = não ocorreu hibridização).
· Microdeleções;
· Monossomias e trissomias;
· Neoplasias. 
· Reação em cadeira de polimerase – PCR:
· Amplificação enzimática exponencial de um fragmento de DNA localizado entre 2 primers;
· Requer:
· Dna-alvo, taq-polimerase, desoxinucleotídeos, primers específicos para o DNA alvo.
· Vantagens: 
· Sensibilidade: pequena quantidade de DNA;
· Segurança: não envolve radiação;
· Velocidade: rápido;
· Simplicidade: base para outras técnicas;
· Resolução: DNA degradado pode ser usado.
· Desvantagens:
· Não pode ser usada para amplificar grandes alelos devido tamanho do molde;
· Conhecimento exato do locus gênico; 
· Alto risco de contaminação da amostra.
· Etapas:
· Desnaturação: aquecimento da amostra até 94 graus celsius; 
· Anelamento: redução da temperatura para 60 graus celsius e adição dos primers;
· Extensão/Alongamento: elevação da temperatura para 72 graus celsius – Taq polimerase se move pela cadeia de DNA entre os primers e sintetiza a fita complementar.
· Deleções e duplicações;
· Expansões;
· Mudança na ordem das bases nucleares. 
· Amplificação de múltiplas sondas dependentes de ligação (MLPA):
· Hibridização de sondas especificas em regiões de interesse do genoma ampliadas usando PCR;
· Variante da PCR;
· Suspeita clínica conhecida;
· Pode amplificar diferentes sequências em uma mesma reação;
· Vários primers são colocados no DNA que vão ser reconhecidos pelo sensor.
· Duplicação: dois primers reconhecidos.
· Deleção: não há reconhecimento.
· Endonucleases de restrição:
· Escolhidas de modo a reconhecer uma sequência no sítio de mutação;
· Produzidas por bactérias;
· Enzima irá cortar ou não cortará o DNA, dependendo de como a mutação estiver presente;
· Investigação de mutação específica.
· Southern-Blot:
· Uso limitado após PCR;
· DNA de fita dupla é digerido pela endonuclease e os fragmentos resultantes são separados pela eletroforese em gel. 
· DNA no gel é desnaturado, transferido para um filtro, hibridizado com sonda marcada radioativamente.
· Limitações: técnica trabalhosa e usa radioatividade. 
· Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP):
· Polimorfismo: variabilidade na sequência de DNA em determinada localização de um cromossomo (loci) com frequência superior a 1% na população. Também atuam como marcadores genéticos, já que são transmitidos associados a outros genes localizados na região cromossômica próxima a eles (linkage). Além de permitir diferenciar um indivíduo de outro através da sequência de DNA. Exemplo de polimorfismo: Sistema ABO.
· Marcadores genéticos: são polimorfismos nos genes que permitem diferenciar indivíduos, populações e espécies.
· Aplicação dos marcadores:
· Variabilidade genética;
· Seleção assistida;
· Teste de paternidade;
· Identificação de indivíduos;
· Melhoramento genético;
· História evolutiva;
· Detecção de sequências.
· Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): amplificação de uma sequência específica do DNA.
· Polimorfismos de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP): é a combinação de dois métodos para estudo molecular, primeiramente realizando amplificação por PCR do gene a ser estudado. Posteriormente realiza-se a digestão do produto amplificado por enzimas de restrição.
· Etapas: 
· a) Digestão do DNA por endonucleases – DNA é fragmentado em pequenos pedaços por cortes extremos cegos (blunt ends) ou extremos coesivos (sticky ends).
· b) Separação por eletroforese – ânodo e cátodo separam os fragmentos em mais densos e menos densos, menos densos possuem menor resistência, consequentemente migrando mais e ficando mais próximo do cátodo, as mais densas possuem maior resistência, migrando menos, consequentemente ficando mais próximo do ânodo.
· c) Transferência para material de nitrocelulose. 
· d) Hibridização com sondas radioativas – são inseridas sondas marcadas com P 32 (fósforo), que vão gerar complementariedade nos fragmentos de DNA que foram transferidos anteriormente, gerando bandas polimórficas.
· Serve para identificar pequenas inserções ou deleções em determinados fragmentos de restrição de um gene, que verá aumentado ou diminuído, respectivamente.
· Vantagens: poder diferenciar homozigotico e heterozigótico. 
· Desvantagens: alto custo, tempo.
· Polimorfismo Conformacional Unifilamentar (SSCP):
· Etapas:
· a) Desnaturação da cadeia pelo calor – após fazer PCR e amplificar os éxons, os produtos sofrem desnaturação e são separados por eletroforese. Qualquer mudança de bases pode alterar o padrão de migração do fragmento, sua mobilidade depende do tamanho de pares de base e estrutura secundária do DNA
· b) Tendência de unirem novamente / descanso em condição não desnaturante – seqüências normais são mais estáveis e tendem a formar pontes de hidrogênio, sequências com mutações são mais instáveis e possuem conformações diferentes. 
· Obs.: as alterações que não modificam o tamanho do DNA, apenas substituem, também podem mudar a mobilidade do DNA em gel não desnaturante. 
· Vantagens: análise de vários produtos da PCR simultaneamente, rápido e fácil execução, baixo custo, não é necessário conhecer a mutação previamente.
· Desvantagens: baixa sensibilidade para mutações em ponto, apenas para segmentos < 250 bps, mudança de base pode não estar correlacionada a doença, resultado positivo requerem posterior seqüenciamento para identificação da mutação.
· Sequenciamento:
· Processo que determina a ordem dos nucleotídeos dentro de uma amostra, muito parecido com a PCR. Precisamos do DNA a ser sequenciado, primers, taq polimerase, nucleotídeos dntp, a diferença é a adição nucleotídeos ddNTP, que são nucleotídeos ACTG quimicamente modificados e marcados com fluorocromo com cores diferentes. A diferença de um nucleotídeo quimicamente modificado é que no normal temos um terminal hidroxila (OH) no carbono 3, que permite que o novo nucleotídeo seja inserido para formação da cadeia, enquanto no modificado não temos o terminal hidroxila, portanto não é possível a inserção de um nucleotídeo. A sequência complementar vai sendo construída com a incorporação de nucleotídeos normais e a medida que um ddNTP for incorporado ele bloqueia a continuação da complementariedade da cadeia, o sequenciamento para no nucleotídeo marcado, no final tem vários fragmentos de tamanhos diferentes.
· Etapas: 
· a) Síntese da cadeia complementar ao DNA-alvo, por PCR.
· b) Reação é interrompida quando nucleotídeos marcados são incorporados à cadeia (ddNTPs).
· c) Geração de fragmentos de DNA com tamanhos diferentes e que terminam em sítios específicos marcados A, C, T ou G.
· Separação por eletroforese (dNTPs – extendem a fita de DNA; ddNTPs – terminam a fita de DNA).
· Os marcadores têm cores diferentes, que possuem diferentes comprimentos de onda ao passar pelo laser.
· Vantagens: pode observar a maioria das mutações.
· Desvantagens: alto custo.
· Hibridização Genômica Comparativa de Microarranjos de DNA (CGH – ARRAY):
· CGH constitui uma hibridização genômica comparativa, paciente e controle, na qual marcadores diferentes, competem pelas sondas na superfície de uma lâmina. Deleções e duplicações são indicadas pela quantidade de fluorescência.
· Resolução de 10 kb a 1Mb (densidade das sondas), quantomaior, mais resolução. É recomendada em aneuploidias, síndrome de microdeleções e microduplicações, diagnóstico pré-natal, diagnóstico pré-implantacional (PGD), desbalanços cromossômicos de até 500pb, moisacismo de baixa frequência e genes específicos.
· Autismo;
· Esquizofrenia;
· Transtorno de déficit de atenção (TDHA);
· Epilepsia idiopática;
· Atraso no desenvolvimento psicomotor ou deficiência mental;
· Abortamento espontâneo;
· Desordens de desenvolvimento sexual;
· Síndrome do supercrescimento;
· Anomalias congênitas cromossômicas.
GENÉTICA MÉDICA
 
Julya Pavão
 
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
 
 
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
 
 
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Hibridização fluorescente in situ (FISH)
:
 
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Sonda: sequência complementar a um segmento de DNA conhecido;
 
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A s
onda se hibridiza com a sequência de DNA do segmento cromossômico 
estudado
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A s
onda tem componentes fluorescentes: 
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região 
onde ocorreu a 
hibridização é visualizada pelo microscópio de fluorescência
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Áreas de abrangência
:
 
 
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Onco
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hematologia: identificação, rastreamento e monitoramento das 
anormalidades cromossômicas
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Genética constitucional: síndromes genéticas específicas
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Diagnóstico pré
-
natal: aneuploidias cromossômicas
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Etapas
:
 
 
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Sonda de DNA marcada com corante fluorescente;
 
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Desnaturação do DNA;
 
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Hibridização da sonda com o DNA;
 
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Multiplicação gênica
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Análise da fluorescência no microscópio ( + = ocorreu hibridização, 
-
 
= não 
ocorreu hibridização)
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Microdeleções;
 
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Monossomias e trissomias;
 
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Neoplasias
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·
 
Reação em cadeira de polimerase 
–
 
PCR
:
 
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Amplificação enzimática exponencial de um fragmento de DNA localizado 
entre 2 primers
;
 
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Requer
:
 
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Dna
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alvo, taq
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polimerase, 
desoxinucleotídeos, primers específicos para o 
DNA alvo
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Vantagens
:
 
 
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Sensibilidade: pequena quantidade de DNA
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Segurança: não envolve radiação
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Velocidade: rápido
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Simplicidade: base para outras técnicas
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Resolução: DNA degradado pode ser usado
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Desvantagens
:
 
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Não pode ser usada para amplificar grandes alelos devido tamanho do 
molde
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Conhecimento exato do locus gê
nico
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