Técnicas de Imunodiagnóstico

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Técnicas de Imunodiagnóstico  
Como utilizar resposta imune (RI) para  
diagnosticar uma doença?   
De meio direto buscando por antígenos.  
Anticorpos (Ac) são utilizados para  
identificar/detectar antígenos ou pode  
ser de meio indireto no qual busca por  
anticorpos específicos no soro do animal  
e determina que ele foi previamente  
exposto a um agente infeccioso.   
Reagentes Utilizados em Testes de Soro 
◇ Soro   
Fonte mais comum de anticorpos,  
produto de sangue coagulado e pode ser  
armazenado congelado e testado  
quando for conveniente.   
◇ Anti-globulinas   
São anticorpos específicos contra as  
imunoglobulinas e é capaz de detectar  
as imunoglobulinas.   
Ex¹: As imunoglobulinas de um cão são  
aplicadas em um coelho, o coelho será  
capaz de produzir anticorpos específicos  
contra as imunoglobulinas do cão.   
◇ Anticorpos Monoclonais   
São anticorpos produzidos por um único  
clone de linfócito B gerados por  
camundongos, cujos os sistemas  
imunológicos foram estimulados pelos  
antígenos de interesse. Podem ser  
utilizados como reagentes químicos  
padrão e em quantidades quase  
ilimitadas.   
Principais Características dos Ensaios de  
Imunodiagnóstico   
◇ Reprodutibilidade    
Refere-se à obtenção de resultados  
iguais em testes realizados com a  
mesma amostra, por pessoas diferentes  
em locais diferentes, remete à  
confiabilidade, precisão do teste  
  
  
◇ Validade   
Grau em que o exame é apropriado para  
medir o verdadeiro valor daquilo que é  
medido, observado ou interpretado.  
Capacidade de produzir valor é muito  
próximos aos obtidos num ensaio de  
referência (padrão ouro), remete à  
acuidade, acurácia ou exatidão.  
◇ Sensibilidade  
É a capacidade de detectar amostras  
verdadeiramente positivas. A  
probabilidade do teste dar positivo em  
pacientes sabidamente doentes, é a  
proporção de resultados positivos  
verdadeiros. Teste com alta sensibilidade  
pode dar elevado número de falsos  
positivos (Reações positivas em  
indivíduos sabidamente sadios)  
◇ Especificidade  
É a capacidade de detectar amostras  
verdadeiramente negativas,  
probabilidade do testes dar negativo em  
pacientes sabidamente sadios. Teste com  
alta especificidade pode dar elevado  
número de Falsos Negativos (teste  
negativo em pacientes sabidamente  
doentes). Quanto maior a especificidade,  
menor a ocorrência de Falsos positivos  
◇ Ponto de corte (“cut  
–off”)  
É o valor que define o limite entre um  
teste negativo e positivo  
Objetivos dos Testes Sorológicos  
◇ Diagnóstico  
É necessário a utilização de testes mais  
específicos, sendo importante evitar os  
testes falsos positivos.  
◇ Para Triagem  
São utilizados com fins preventivos,  
busca-se evitar os testes falso-negativos  
– testes mais sensíveis e permite a  
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detecção precoce de doenças,  
melhorando o prognóstico  
◇ Testes Sorológicos  
Qualitativos: resultados informam se  
houve ou não reação ( + ou -)  
Quantitativos: há determinação de um  
valor dentro de uma determinada escala  
Semi-quantitativo: amostra testada é  
diluída (a maior diluição a apresentar  
reação é o seu título)   
Quantitativo: informa a quantidade  
absoluta do material detectado  
Reação de Imunofluorescência   
Reação baseada na reação  
antígeno-anticorpo  
Conjugado: Anticorpo é marcado com  
pigmentos/corantes fluorescente  
◇ Imunofluorescência  
Direta  
Pesquisa a presença de antígenos em  
células ou tecidos através de um Ac  
fluorescente   
Detecções diretas de microrganismos em  
secreções, urina, fezes e em cortes de  
tecidos  
Anticorpo contra um antígeno específico  
é acoplado ao FITC.  
O tecido é fixado a uma lâmina de vidro  
e incubado com o anticorpo marcado.   
Quando examinados em um microscópio  
com luz ultravioleta, os anticorpos que  
reconhecem e se ligaram aos antígenos  
irão exibir intensa fluorescência.  
Vantagens: alta especificidade e  
sensibilidade, possibilidade de detecção  
de proteínas intracelulares e de sua  
localização  
Desvantagens: alto custo com o  
microscópio de epifluorescência,  
necessidade de um conjugado para cada  
antígeno que se deseja localizar ou  
identificar, subjetividade na leitura   
Utilização: Erliquiose, Raiva  
◇ Elisa - Ensaio  
Imunoenzimático   
Base: reação antígeno anticorpo,  
detectar a presença de Ag ou Ac em  
fluidos corporais ou sobrenadantes de  
culturas  
Complexo Ag/Ac e a sensibilidade de  
uma reação enzimática: enzima e  
substrato  
Utiliza um conjugado (anticorpos  
marcados com enzima) e substrato  
cromogênico (leva à mudança de cor)  
Vantagens: rápido 2-3 horas,  
automatizável, alta sensibilidade  
(detecta quantidades mínimas de Ag ou  
Ac), alta especificidade (detecta  
somente o Ag ou Ac pesquisado),  
pode-se testar várias amostras de uma  
só vez  
Desvantagens: alguns kits comerciais  
podem ser caro, equipamentos de leitura  
com alto custo, alguns reagentes podem  
degradar  
◇ Direto ou sanduíche  
Detecta o Antígeno  
Aplicações: Dosagem de hormônios,  
marcadores tumorais, proteínas séricas,  
detecção de antígenos virais e outros  
patógenos nas fezes, urina e em  
secreções; Triagem na indústria de  
alimentos (pesquisa de patógenos e  
contaminantes nos alimentos)  
◇ Indireto  
Detecta o anticorpo  
Aplicações: Diagnósticos sorológicos de  
doenças infecciosas para a detecção de  
Igs, como Doença de Chagas,  
Leishmaniose, Toxoplasmose,  
Erliquiose...  
Microplaca de poliestireno  
com 96 poços. Cada poço é  
uma amostra.  
◇ Imunocromatografia   
Teste rápido qualitativo (5 -15 min)  
Triagem feita no próprio ambulatório  
Fácil interpretação e alta sensibilidade e  
especificidade  
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Utilizado para detecção de anticorpos ou  
antígeno  
Aplicações: detecção de doenças  
infecciosas e parasitárias, como dengue,  
malária, leishmaniose visceral, FIV, FELV,  
cinomose, parvovirose canina.  
Amostra passa por uma tira porosa;  
Direta : Amostra passa pela zona de  
detecção, que possui anticorpos contra o  
antígeno ligados a ouro coloidal (rosa)  
ou selênio coloidal (cor azul);  
Indireta : Amostra passa pela zona de  
detecção, que possui antígenos ligados a  
ouro coloidal (rosa) ou selênio coloidal  
(cor azul);  
Forma imuno complexos Ag + Ac  
Sempre tem que ter uma banda de  
controle   
Resultado positivo: linha rosa ou azul  
surge na zona de detecção  
◇ Teste da AglutinaçãoRápida   
Rápido, Barato; Fácil;   
Prova pode ser realizada a campo  
É o agrupamento de antígenos após a  
interação com anticorpos específicos,  
levando a uma alteração do estado  
físico.  
Os anticorpos, uma vez ligados, levam  
as partículas a se agruparem de modo  
visível num fenômeno conhecido como  
aglutinação/coagulação.  
◇ Teste de Aglutinação  
rápida  
Teste do Antígeno acidificado  
tamponado (AAT):  
Destinado à triagem sorológica para  
Brucelose  
O soro do animal é misturado ao  
antígeno (suspensão de Brucella abortus  
corada com Rosa Bengala).   
No caso da amostra possuir anticorpos  
contra a bactéria, desenvolve-se uma  
reação de aglutinação visível a olho nu  
◇ Imunodifusão em Gel de  
Ágar (IDGA)   
Técnica simples, barata, e qualitativa.  
Sensibilidade e especificidade razoável  
Princípio: precipitação de complexos  
Ag-Ac  
Utilizada principalmente para detectar  
anticorpos, contudo pode ser usada para  
detectar antígenos  
Muito utilizada como técnica de triagem  
Desvantagens:   
Pode não detectar níveis baixos de  
anticorpos   
Reações inespecíficas  
Tempo de obtenção dos resultados  
(incubação até 72 horas)   
Aplicações: Anemia Infecciosa Equina,  
Leucemia Viral Bovina, Leucemia Viral  
Felina, Artrite Encefalite Caprina...  
Um poço é preenchido com antígeno e  
outro com amostra (soro).  
Positivo: Ag e soro se difundem e se  
encontram formando uma linha de  
precipitação no gel observada a olho nu.  
Negativo: não forma a linha de  
precipitação  
◇ Hemaglutinação  
Capacidade hemaglutinante de alguns  
vírus  
Alguns vírus podem se ligar e aglutinar  
eritrócitos de mamíferos e aves  
Rápida, fácil, de boa sensibilidade e  
especificidade  
Pesquisa de antígeno (fluidos corporais,  
suspensões de tecidos, fezes)   
Aplicação: diagnóstico da parvovirose  
canina  
A proteína do capsídeo viral confere ao  
vírus a capacidade de aglutinar  
hemácias de suíno in vitro  
◇ Fixação do  
Complemento  
  
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Presença de anticorpos leva a ativação  
do complemento e lise da célula  
(eritrócito)  
Boa sensibilidade e especificidade;  
Contudo: demorado, trabalhoso, não  
automatizável;  
Utilizado para exames de Mormo  
Um soro teste é titulado em diluição  
seriada e uma quantidade fixa de  
antígeno é adicionada a cada poço.  
Etapa 1- No soro teste coloca-se  
antígenos específicos. Se o anticorpo  
estiver presente no soro, formam-se  
complexos imunes.  
Etapa 2- O complemento é então  
adicionado à solução e se junta ao  
complexo imune formado, sendo fixado  
e consumido.   
Etapa 3- As células indicadoras  
(eritrócitos), juntamente com anticorpos  
anti eritrócito) são adicionadas à  
mistura.  
Se houver qualquer complemento  
remanescente, estas células serão  
lisadas.    
Se o complemento tiver sido consumido  
na etapa dois pelos complexos imunes  
(Ag- Ac), as células não serão lisadas.  
◇ Imunohistoquímica  
Combina técnicas histológicas,  
imunológicas e bioquímicas objetivando  
identificar antígenos tissulares através  
de Ac específicos  
Possibilita visualizar a distribuição e  
localização do antígeno  
Enzimas conjugadas às imunoglobulinas  
são utilizadas para localizar antígenos  
em cortes de tecidos  
Peroxidase: marcador mais utilizado  
Vantagens: baixo custo a moderado, alta  
sensibilidade e especificidade, análise de  
um antígeno em vários tecidos em uma  
mesma lâmina  
Desvantagens: mão-de-obra, longo  
tempo, variabilidade do resultado  
conforme a leitura realizada pelo  
observador  
  
  
  
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