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Biotecnologia da Reproducao e Melhoramento genetico Reprodução assexuada ou Agâmica: Ocorre sem a participação de gametas, logo não há troca de material genético Sexuada ou gâmica: Ocorre com a participação de gametas (fusão), logo há troca de material genético Importância do macho Produção de sêmen. Capacidade de serviço. Efeito de presença. Indicado para avaliação do aparelho reprodutor antes da estação de monta, comercialização de reprodutores, determinação da ocorrência da puberdade e diagnósticos de problemas de fertilidade. Etapas Identificação do animal. Anamnese completa: Manejo nutricional e sanitário. Número e frequência de acasalamentos. Taxas de gestação em acasalamentos anteriores. Informações da progênie. Testículos: Simetria, consistência, mobilidade, temperatura, sensibilidade, tamanho e biometria. Epidídimos: Tamanho, consistência, mobilidade, sensibilidade. Prepúcio: Aumento de volume, prolapsos, abscessos, hematomas, cicatrizes e óstio prepucial. Glândula acessórios: Tamanho, forma, lobação e sensibilidade. Observação do comportamento sexual: Atitude, por meio de tabela. Colheita e análise do sêmen Sêmen: Suspensão celular contendo espermatozoides e fluído secretado pelas glândulas sexuais acessórias; Porção celular: Espermatozoides (produzido nos túbulos seminíferos). Porção Fluida: Plasma seminal (transporte e proteção dos espermatozoides) Métodos técnicas de colheita Vagina artificial Melhor técnica de colheita, pois simula a cópula natural. Utilizado para a maioria das espécies. Composição da vagina artificial: Tudo rígido com válvula, mucosa de borracha, cone flexível e tubo de colheita recoberto com capa térmica (temperatura ideal entre 39 a 42ºC). Vantagens: Sêmen de melhor qualidade e com menos risco de contaminação no ambiente. Desvantagens: Necessidade de treino para machos doadores. Eletro ejaculação Esse estímulo produz a ejaculação, indicado para a colheita de machos de diferentes espécies nos quais a colheita por vagina artificial não é possível. Procedimento: O aparelho é inserido no reto com eletrodos em forma de anéis longitudinais que promovem a estimulação elétrica. Desvantagens: Estresse animal e maior diluição seminal camparado a colheita com vagina artificial. Excitação mecânica Método utilizado para obtenção de sêmen de caninos e suínos. Procedimento: Excitação manual do corpo do pênis. Desvantagens: Método restrito a animais mansos e treinados, oferece um risco potencial de contaminação do sêmen. Caninos: Sêmen composto por três frações distintas. Primeira: Líquido claro, aquoso que representa secreção das glândulas uretrais. Seu volume tem variação de 0,25 a 5 ml. Segunda: Branco, viscoso e contém espermatozoides. Seu volume tem variação de 0,5 a 3 ml. Terceira: Clara, aquosa, pouco consistente. Seu volume tem variação de 3 a 30 ml e representa secreção prostática. Suínos: Sêmen composto por três frações distintas. Primeira: Pré-espermática translúcida. Segunda: Rica em espermatozoide, esbranquiçada e opaca. Terceira: Pós-espermática, translúcida. Colheita em outros animais Aves: Massagem abdominal. Camundongos: Retirada do epidídimo e ducto deferente. Peixe: Massagem abdominal. Avaliação do pênis Aspecto e volume Coloração uniforme, aparência opaca ou cremosa que indica alta concentração espermática. O volume é utilizado para cálculo da dose espermática, fazendo a estimativa do número total de células. Motilidade e vigor Análise realizada no microscópio óptico, verifica a viabilidade e qualidade espermática. Procedimento: 10 a 20 ul de sêmen são colocados entre a lâmina e a lamínula. Vigor: Velocidade em que as células atravessam o campo e formam onda.(0 a 5). Motilidade: Contagem de células móveis e estimado o porcentual. (70 a 90%). Análise computadorizada de motilidade-Casa: Sistema automatizado para visualizar e digitalizar imagens sucessivas dos espermatozoides, processa, analisa e fornece informações da cinética individual das células e valores estáticos. Concentração espermática Determinada por hemocitômetro e espectrofotômetro. Procedimento: Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água par para facilitar a contagem que é feita pela câmara de Neubauer. Morfologia Estima porcentual de células normais e células patológicas. Procedimento: Amostra é diluída e conservada em formol salina. Avaliação é feita através de esfregaço e coloração (hematoxilina-eosina, giemsa e rosa de bengala), devem ser avaliados 100 a 200 sptz. Anormalidade espermáticas: Primárias: Associada a cabeça e acromossomo. Secundárias: Gotas citoplasmáticas. Terciárias: Defeitos de cauda. Volume médio ejaculado Bovino: 5-8 ml. Ovino: 0,8-1,2 ml. Caprino: 0,8-1,2 ml. Suíno: 150-200 ml. Equino: 60-100 ml. Galo: 0,2-0,5 ml. Concentração média espermática milhões/ml: Bovino: 800-2000 x 10 elevado a sexta sptz/ml. Ovino: 2000-6000x 10 elevado a sexta sptz/ml. Caprina: 2500-5000 x 10 elevado a sexta sptz/ml. Suíno: 200-300 x 10 elevado a sexta sptz/ml. Equino: 150-300 x10 elevado a sextasptz/ml. Galo: 3000-7000x 10 elevado a sexta sptz/ml. Espermatozoides normais: Bovino: 65-95% Ovino: 80-95% Caprino: 80 -95% Suíno: 70-90% Equino:60-90% Galo: 85-90%. Inseminação artificial (IA) é a ferramenta mais amplamente aplicado na pecuária moderna. Usado para melhoramento genético de animais de produção, controle de doenças, otimização da criação e exploração de macho através de programas de IA e conservação de material genético de animais com risco de extinção. Preservação do sêmen Resfriamento O resfriamento de SPTZ a 5-8ºC: Aumenta a sobrevivência de 24-96h, reduz a taxa metabólica e prolonga a sobrevivência. SPTZ a cada 15ºC de redução de temperatura: Metabolismo é reduzido em 45%. SPTZ armazenados a 5ºC: Taxa metabólica é apenas de 10%, sem diminuição significativa, taxa de motilidade e taxa de fertilização. Congelação Congelação de SPTZ-196ºC: Preservação de SPTZ por tempo indeterminado, parada do metabolismo sptz, viabilidade do esperma é reduzida em 50%, capacidade de fertilização é reduzida sete vezes após a criopreservação. Efeitos adversos sobre os espermatozoides, redução na taxa de viabilidade, integridade estrutural, redução na motilidade e redução na taxa de concepção. Resfriamento de SPTZ a 5-8 °C Congelação de SPTZ a – 196 °C Temperatura que causa danos aos espermatozoides Período de super- refrigeração (0 – 5 °C), Estresse osmótico. Período de formação de cristais de gelo - 6 a -15 °C, problema pode ser superado pela técnica denominada seeding. Crioprotetores Substituem e/ou removem a água intracelular Sêmen fresco e os Crioprotetores que amenizam a situação: Vida útil mais curta e menor taxa fecundação, diferença atribuída á taxa de geração de O2-e H2O2 e concentração intracelular de iões de cálcio livres (Ca2 +). Extensores base de gema de ovo: Reduzem significativamente o nível intracelular de radicais Livres. Tratamento pós-descongelação de sêmen congelado com tióis: Antioxidantes impedem danos na membrana provocados por H2O2 e perda de motilidade espermática e Vitamina E e C. Fatores que afetam sucesso de criopreservação Toxicidade do crioprotetor, taxa de resfriamento, taxa de aquecimento, embalagens, variação individual do animal. Observação: Alguma perda de viabilidade do espermatozoide é inevitável devido aos procedimentos de processamento antes de congelação, bem como durante o processo. Efeitos deletérios da criopreservação nas organelas espermática Indução da reação acrossomal prematura, alteração na função mitocondrial, redução da motilidade, falha na Descondensação da cromatina, arrefecimento (reorienta de fosfolipídios), interromper a função e a permeabilidade seletiva da membrana, diminui o metabolismo celular, alteração da permeabilidade da membrana, perda de componentes intracelulares, perda irreversível da motilidade espermatozoides, aumento do número de espermatozoides mortos. Intracelulares (penetrantes) Dimetilsufóxido (DMSO), glicerol, etilenoglicol, metanol, propanodiol Extracelulares (não penetrantes) Manitol, lactose, sacarose, polivinilpirrolidona, glicose, trealose, gema de ovo, leite e albumina sérica bovina (BSA). Efeito no metabolismo dos espermatozoides As mudanças estruturais na membrana dos espermatozoides pós descongelamento, alteração na capacidade de produção de energia na forma de ATP. Glicose-6-fosfato-desidrogenase: Sai da célula quando a membrana celular é danificada durante a criopreservação. Queda na motilidade de espermatozoides Stress oxidativo: Temperatura ambiente o espermatozoide usa preferencialmente a via glicolítica para síntese de ATP em detrimento a fosforilação oxidativa. Incapacidade para sintetizar antioxidantes e alta capacidade de produzir aniões superóxido (O2) e peróxido de hidrogénio (H2O2) através da respiração mitocondrial com mecanismo de defesa antioxidante endógena restrito. Alteração da membrana via congelamento Alterações em membrana causada pela criopreservação: Fluidez das membranas, Proporção colesterol/fosfolipídios e relação proteína/fosfolipídeo. Diferença da criosensibilidade de espermatozoides de diferentes espécies: Cada espécie contém uma composição de membrana diferente e proteínas de fixação periférica. Efeito da criopreservação na capacitação Capacitação e hiperativação prematura, aumento intracelular de cálcio (aumento das concentrações de íons de cálcio desencadeiam sinais intracelulares de capacitação). Criopreservação: Alterações na membrana do espermatozoide, influxo de cálcio, capacitação prematura, efeito da criopreservação no espermatozoide e diminuição do estresse osmótico no espermatozoide. Crioprotetores: Compostos com baixo peso molecular em alternativa ao glicerol, Metil- formamida, Dimetilformamida, Etilenoglicol e Dimetilacetamida. Proporcionam maior motilidade do sptz pós-descongelamento. Lipoproteínas de baixa densidade (LDL): Efeito benéfico na função espermática pós-descongelação e DNA-integridade. Usado para controle da saúde genital, diagnóstico, prognóstico, tratamento e determinação do ciclo estral. Indicações para realização do exame Seleção de matrizes: Alterações hereditárias e congênitas, além de pelvimetria (Determina o padrão pelvimétrico para cada raça, serve como métodos profiláticos contra complicações que possam ocorrer durante o parto, além de permitir a classificação anatômica e obstétrica da pelve). Avaliação obstétrica: Diagnóstico de gestação, pré-natal e alterações no parto e no puerpério. Avaliação clínica: Determinação de ciclo astral (reprodução assistida). Diagnóstico de afecções reprodutivas: Infertilidade ou hidrossalpinge. Identificação do animal: Anamnese completa. Preparação para o exame: Contenção, limpeza da ampola retal, higienização da região perineal e assepsia instrumental. Observação de condição corporal e funções vitais. Observação do comportamento sexual Visão, interação com outras fêmeas ou machos. Olfação/gustação, captação do feromônio via órgão Vomeronasal. Comportamento de lambedura e captação de urina, audição, vocalizações, táctil, pressão sob a glande estimulado pelo sistema nervoso e ereção e ejaculação. Vulva e períneo Método direto: Inspeção e palpação, observa-se a conformação, abertura dos lábios vulvares, tamanho e aumento de volume, identificação de lacerações e retratação cicatriciais, identificação de mal formação, secreção, corrimentos, estruturas e identificação de ação hormonal. Observação: Fêmeas freemartin, apresentam clitóris hipertrofiado, presença de pelos longos na vulva, vagina mais curta, em fundo cego, sendo em algumas regiões do Brasil chamada de vaca "maninha", o apresenta características de machos (pescoço e espáduas musculosas), a ausência de cérvix, os ovários poucos desenvolvidos ou ausentes, o pouco desenvolvimento do sistema mamário, vestígios de gônadas masculinas. Glândula mamária Métodos diretos, inspeção e palpação e métodos indiretos com avaliação citológica, avaliação microbiológica e US. Vagina Vaginoscopia e toque vaginal, observando a coloração da mucosa e pregueamento vaginal. Vaginoscopia/Exame vaginal: Para realização do exame é feito o preparo da fêmea com a contenção e limpeza do reto com sabão neutro e secagem. Os materiais utilizados são limpos via método de flambagem. Assim é feito a introdução do espéculo, angulo de 45 graus, ao encostar no teto da vagina, colocar na posição horizontal e ir até o final. Formato: Porção vaginal deve ser cilíndrica ou cônica, roseta, papila ou aba. Abertura: Fechada significa o diestro (gestação) e aberta significa (estro). Coloração da mucosa: Pálida significa anestro ou prenha, rosa pálida diestro, hiperêmica estro ou infecções e vermelha patológica. Umidade: Grau de umidade ou presença de secreção. Útero Métodos indiretos como ultrassonografia e raio-x, realizando a avaliação do diâmetro e conteúdo ou bacteriologia e biópsia uterina. Tuba uterina Difícil avaliação, lapatotomia exploratória, laparoscopia e radiografia contratada. Ovários Palpação retal com a observação do tamanho. Consistência dos folículos: Firme e tenso, sem flutuação, flutuação tensa, nítida, intensa (folículo maduro), flácida, macia (logo após a ovulação). Consistência do CL: Macio (início do ciclo), textura hepática (meio do ciclo) e endurecido (final do ciclo). Citologia vaginal ou Vaginoscopia: Faz a identificação do hormônio sexual circulante. Dosagens hormonais: Estrógeno, progesterona, GnRH (fsh e lh) com detecção do período de fecundação). Acesso ao trato genital pelo reto, feito a exploração manual do cérvix, útero, tubas e ovários. Usado em éguas e vacas para diagnóstico de gravidez, pode ser realizado no início da gestação, resultado imediato e 1005 precisa. Útero gestante: Bovino Primeiro mês: Presença da vesículaamniótica (1 cm ) – ápice do corno, útero túrgido, corpo Lúteo desenvolvido em um dos ovários. Segundo mês: Aumento do corno gestante com presença de líquidos fetais. 40 dias, belisca mento mais o deslizamento da parede uterina com as membranas fetais. Terceiro mês: 65 dias (feto palpável), 75 dias (cotilédones) e inicia a descida do útero para a cavidade abdominal. Quarto mês: Aumento da artéria uterina média, pulso frêmito (a partir dos 120 dias), útero no assoalho da cavidade abdominal, feto de difícil identificação e presença dos cotilédones (2-5 cm) na parede uterina. Útero gestante equino Primeiro mês: Cérvix contraída e firme (papável) e corpo Lúteo desenvolvido em um dos ovários. Segundo mês: Cornos uterinos túrgidos e projeção vesícula embrionária semelhante a uma laranja. Terceiro mês: Vesícula embrionária cresce rapidamente e desce para o corpo uterino, forma oval. Tensão uterina é gradualmente perdida e inicia a descida do útero para a cavidade abdominal. Quarto mês: Superfície uterina distendida, fetos e/ou porções fetais são palpáveis. Quinto ao sétimo mês: Útero no assoalho na cavidade abdominal e difícil palpação do feto. Sétimo mês ao final: Útero no assoalho na cavidade abdominal e difícil palpação do feto. Ultrassonografia Método de eleição para diagnóstico de gestação (DG) é a identificação dos movimentos fetais, pulso, circulação arterial, batimentos cardíacos. Permite a identificação da DG precoce. Os diagnósticos precisos e imediatos, pode ser utilizado no campo e mão de obra é especializada. Sonar doppler - Efeito doppler Ausculta o batimento cardíaco do feto e fluxo sanguíneo do cordão umbilical. Porcas: 46 -77 dias. Radiologia DG: Baseia-se na identificação do esqueleto fetal. Desvantagem: Deve ser utilizado no terço final da gestação (cadela- a partir 42 dias ), caro, necessidade de contenção farmacológica (grandes) e radiação do operador. Citologia/Biópsia vaginal Detecta modificações histológicas que ocorrem no epitélio da vagina durante a gestação com 45 – 95% de precisão. Dosagem hormonais Progesterona, permite DG em estado precoce, técnica ELISA, eficiência – 75- 85% (gestação – corpo Lúteo ) e custo. Indices zootécnicos Característica manejo bovinos de corte Fase: Época de parição estacional. Problema: Anestro (Presença do terneiro e condição nutricional). Solução Efeito mamada Primíparas: Crescimento (Oferta de alimento, campo nativo), amamentação mais reserva de energia. Condição corporal: Colesterol gera gordura corporal, produção de hormônios esteroides. Para manter uma boa condição temos as alternativas: Desmame precoce, interrompido ou controlado. Desmame precoce: Consiste em separar o terneiro aos 90-120 dias de vida, reduzindo a demanda energética da vaca, eliminado o bloqueio gerado pela presença do terneiro. Usa-se o método de creep-feeding, com o objetivo de aumenta o ganho de peso dos bezerros através de cocho privativo, dentro de um cercado onde somente o bezerro tem acesso. Trata- se de um reforço alimentar com uma ração concentrada balanceada enquanto o bezerro ainda está mamando. Desmame temporário ou interrompido: Consiste em separar o bezerro da vaca, por um período de 48 a 72 horas, a partir dos 40 dias após o parto. Há uma redução de desmame energético, pode melhorar a taxa de concepção das vacas em até 30%. Desmame controlado: Permanência do terneiro com a mãe durante dois curtos períodos do dia, entre 6 e 8 horas e das 16 às 18 horas, a partir do 30º dia de vida. Observação: Inviável para grandes rebanhos de bovinos de corte. Ordem de prioridades • Reprodução • Reservas • Lactação • Crescimento • Mantença Época de parição Alternativas Redução da época de Monta. Sincronização da ovulação. IATF. Índices zootécnicos Características manejo de bovino de corte Fase: Parição anual. Problema: Balanço Energético Negativo (Produção de leite) e Detecção de cio. Soluções Balanço energético negativo (BEN) Alternativas nutricionais: Tem objetivo de reduzir o déficit energético. Ofertar uma dieta de alta energia, suplementos que aumentam a energia da dieta como gorduras e proteínas e suplementos que melhores o aproveitamento da dieta como levedura ou Ionóforos. Condição corporal: Monitoramento dos animais e ajuste da dieta para que no momento do parto estejam com um ECC entre 2,75 e 3,0, porque perdem muita condição corporal após o parto. Sinal de cio: Estradiol. Estrotec. Rufião (boi). Pedômetro. Sincronização do cio: Usado mais em gado de corte com a estação de monta, em bovinos de leite são usados após 40 dias pós parto. Concentra a apresentação do cio e não elimina a observação do cio. Observação: Vacas de alta produção consomem mais alimento, com isso, o metabolismo é mais acelerado gerando uma maior degradação dos hormônios esteroides. (IATF) Princípios 1°Altos níveis de Progesterona –CIDR/DIB 2°Indução de uma nova onda de crescimento folicular- Benzoato de estradiol-Be/GnRH. 3°Redução dos níveis de Progesterona- PG/ Retirada do CIDR 4°Altos níveis de estrogênio- BE/ECP(Cipionato de Estradiol) Inibição da secreção de LH, encurtamento do tempo de vida do corpo lúteo, estimular início do cio, estimular evolução. Controle das fases do ciclo astral Sincronizar a emergência da onda folicular: Indução de ovulação (GnRH) e atrasia folicular (p4 e E2). Encurtar a duração da fase luteal: PG. Prolongar a duração da fase luteal: P4. Induzir a ovulação na fase folicular: GnRH, LH e E2. Induzir o crescimento folicular em animais em anestro: FSH, eCG. Hormônios que podem ser usados Progesterona: Uso via oral, implante subcutâneo, dispositivo intravaginal. Inibição da ovulação por feedback negativo para liberação de LH (mimetiza ação do CL), FD sofre atresia, queda do p4 após a retirada do implante, ausência do bloqueio EHH, folículo termina de se desenvolver e ocorre a ovulação.Sicroniza fêmeas ciclando e induz ciclicidade em fêmeas em anestro. Bovinos de corte • Melhoramento genético. • Elimina a detecção de cio. • Concentrar a época de parição. Bovinos de leite • Melhoramento genético. • Elimina a detecção de cio. • Utilizada ao logo do ano. Requisitos • Adequado Período Voluntário de Espera (PEV). • Adequado ECC. • Avaliação ginecológica prévia dos animais. • Adequado controle Sanitário. Estrógenos: Injeção ou implantes. Intensifica a ação da P4, sincronização de ondas foliculares, inicialmente promove supressão da secreção de FSH e LH, atresia de folículos. Na ausência de P4, induz GnRH e Lh na ovulação do FD e induz o cio. Em bovinos, quando aplicado luteolítico no início do tratamento (menos eficiente que a PG), emergência de uma nova onda. Valerato de estrádio (VE), Benzoato de estradiol (BE) e cipionato de estradiol (CE) e E2. Prostaglandina (PGF2alfa): Lutólise, diminuiçãoda P4, liberação de gonadotrofinas, ovulação. GnRH: Níveis máximos de FSH e LH (2 horas), estimulado na presença de E2, inibido na presença de P4, fase folicular induz a ovulação (24 a 48 horas após administração). Gonadotrofina corônica equina (eCG): Cálices endometriais da égua, FSH e LH, desenvolvimento folicular e ovulação, rebanhos com baixa taxa e ciclicidade, fêmeas recém formadas paridas e com baixa condição corporal. Protocolos de sincronização OVSYNCH. CIDR. Crestar: Progestáno mais potente que a p4. A inseminação artificial constitui importante, se não a mais eficiente, de baixo custo e segura forma de inserção e progresso genético em ruminantes domésticos. Sua viabilidade, todavia, é limitada pelo potencial comprovado da genética veiculada via sêmen, sistema de produção e pela eficiência técnica com que é desenvolvida. Poliéstrica estacional Coleta sêmen Dieta em proteína 6-8 semanas antes da coleta. Deve ser coletada via treinamento, vagina artificial ou eletroejaculador. Identificação das fêmeas em cio Cabras: Observação dos sinais do cio, rufião. Ovelhas: Difícil observação dos sinais de cio, rufião. Classificação do muco Sincronização e indução do estro e da ovulação Vantagens: Uso maximizado de reprodutores, associados a monta dirigida. Sincronização de partos facilitando o manejo sanitário nutricional, permitindo lotes homogêneos de recria, programação de acasalamentos (férias e final de semana). Uso eficiente da inseminação artificial, transferência de embriões, parição no outono e inverno, diminuição do intervalo de partos (aumenta a vida produtiva do animal durante a vida). Desvantagens: Exigência de treinamento específico, administração de drogas, custo relevado de todo o material. Transmissão de doenças entre os animais e para o homem se não forem utilizados materiais descartáveis, luvas e equipamentos esterilizados. Métodos Efeito macho: Consiste no afastamento de machos do rebanho por 60 dias, quando são reintroduzidos e induzem alto percentual de estro nas fêmeas em 72 horas. Custo baixo, secreção de LH (2-4 minutos) e ovulação em 3 dias após o primeiro contato com ciclo de 5 a 6 dias. Efeito macho e Progestáno. Foto período artificial. Métodos farmacológicos: Ovelhas (progestános, esponjar, CIDR, implantes auriculares) e cabras (Protagénos, esponjas, CIDR, implantas auriculares). Protocolo de inseminação artificial Detecção do cio: Após a aceitação da monta. Cabra: 12 a 18 horas. Ovelha: 15-17 horas. Sincronização: Cabra: 30 e 48 horas, após a retirada do implante. Ovelhas: 50 a 60 horas, após a retirada do implante. (colocar em um quadrado) Melatonina: utilizada próxima à estação de acasalamento natural com a intenção de antecipar. Todavia, podem ser utilizados no final da estação de acasalamento ou início da estação de anestro. Nestas últimas condições, ovelhas submetidas a implantes de melatonina por 40 dias associadas ao efeito macho (apresentação do macho no momento da retirada do implante), apresentaram taxas de concepção de 78%. Técnicas de Inseminação artificial Vaginal: Vaginoscópio, sêmen fresco com baixas diluições (500 x 106 espermatozoides por dose). Não indicada para sêmen congelado, não se observa o local de deposição do sêmen, contenção e manipulação mínimas e Tx de prenhez baixa. Pericervical/ Intracervical: Fertilidade superior a vagina, localização do orifício caudal da cérvice (espéculo/luz).Deposição de sêmen mais profunda possível (1 – 2 cm).Sêmen fresco (200 a 300 x 106 espermatozoides por dose)e não indicada para sêmen congelado. Inseminação cervical profunda ou intra-uterina pela via cervical: Localização do orifício caudal da cérvice (espéculo/luz). Uso de instrumentos facilitadores (espéculos, aplicadores, pinças). Deposição de sêmen mais profunda possível (2 – 4 cm), requer técnicos bem treinados (Requer cuidado maior para não perfurar a cérvice e o corpo do útero). Sêmen fresco (100- 150 x 106 espermatozoides por dose) ou congelado (100 x 106 espermatozoides por dose). Fertilidade diretamente proporcional à penetração. Em cabras 60% e em ovelhas 6% de sucesso (deposição). Intrauterina por lararoscopia: Custo elevado equipamentos, técnico especializado, deposição de sêmen nos cornos uterinos, requer anestesia, sedação, tricotomia. Sêmen fresco ou congelado (100 x 106 espermatozoides por dose), risco de perfurações gastrintestinais, de bexiga (estimular reflexo de micção antes da inseminação) e de vasos sanguíneos. Fertilidade superior todas as outras técnicas, complicações cirúrgicas. Taxa de prenhez elevada, feita exclusivamente por veterinários. Possibilita reprodução entre animais com alterações de comportamento, supera particularidades raciais que possam dificultar a monta, possibilita a utilização de técnicas de reprodução assistida. Favorece o melhoramento genético rápido e eficiente, além de proporcionar acasalamentos genéticos dirigidos. Possibilita acasalamento entre animais que vivem em regiões distantes, aumento do número de descendentes de um cão e uso de machos após a morte. Controle de doenças, prevenção de acidentes que podem ocorrer com a fêmea quando o macho é muito pesado ou agressivo. Importante para aumentar o sucesso da inseminação artificial, identificação da fase, citologia vaginal, Vaginoscopia, dosagens hormonais e sinais e alterações compatíveis com o cio. Citologia vaginal Identificar o estro e repetir a cada 48h. Iniciar 6-7º dias de cio. Vaginoscopia Identificar o pico de LH e ovulação, repetir a cada 2 dias. Iniciar 6-7º dia de cio. Sinais e sintomas do cio • Edema de vulva. • Secreção vaginal. • Receptividade sexual. Dosagens hormonais: Progesterona. Identificar o pico de LH e ovulação, repetir diariamente ou a cada 2 dias. Iniciar na presença de mais de 70% células superficiais anucleadas, imunoensaio e kits rápidos. Dosagens hormonais: LH. Pico tem duração de 24h, repetir diariamente. Iniciar quando P4 estiver entre 1-2 ng/ml e quando Vaginoscopia demonstrar mudança de fase. Comportamento, citologia Vaginal, Vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. O sêmen é depositado no interior do trato reprodutivo da fêmea, podendo ser sêmen fresco, congelado ou refrigerado. Utilidade do sêmen criopreservado Mercado PET: Animais que vivem em locais distantes, utilização de material genético de alto valor zootécnico. Reserva biológica de machos de ótimo background genético. Preservação animal: Crioproteores utilizados são o glicerol ou etileno glicol. Reserva biológica do país e FrozenZoo. Refrigeração do sêmen de cão: Menores danos à integridade da célula, o sêmen de cão reaquecido tem alta fertilidade em curto tempo de preservação. Manutenção do sêmen a uma temperatura de 5ºC por até 72 horas, método ideal para o transporte de sêmen. Causa menores danos à integridade da célula, taxas de concepção de aproximadamente 80%. Manejo do ciclo estral e técnica de inseminação mais fáceis e baratos. Valores de referência • Menor 1,0 ng/ml = Anestro/proestro • 1,0-2,0 ng/ml = Pico de LH • 4,0-10,0 ng/ml = Ovulação • Maior 10,0-15,0 ng/ml = Maturação oocitária Finalidades da criopreservação congelado ou refrigerado Baixa metabolismo espermático Aumenta sobrevida do sêmen Utilizaçãodo sêmen no momento desejado. Congelação do sêmen de cão: Longo período de conservação, maiores danos à integridade da célula. O sêmen de cão descongelado tem baixa fertilidade em curto tempo de utilização. Manutenção do sêmen à temperatura de 196ºC por período de tempo indefinido, baixas taxas de motilidade ao descongelamento. Deve ter o diluidor adequado que deve conter crioprotetor, dose inseminante de 150 milhões de sptz Viáveis, deve sobreviver de 18 a 24 horas após o descongelamento. Técnica de deposição do Sêmen no Trato Reprodutivo da cadela Fundo de Vagina: Pipeta plástica rígida e seringa plástica. Transcervical: Cateter Norueguês. Endoscopia: Utilizado para a cateterização cervical. Intra uterina: Laparoscopia ou laparotomia. Diluidores para transporte de sêmen canino. Diluidor a base de leite desnatado e glicose: • TRIS sem glicerol. • Glicina Gema sem Glicerol. • Meio a base de leite desnatado e glicose. Cuidados com o equipamento para o transporte sêmen O sêmen deve ser acondicionado em recipientes resistentes, a temperatura do equipamento de transporte não pode ser NUNCA inferior a zero. Deve haver um sistema de refrigeração para manter e a temperatura entre (0 a 18ºC). O equipamento de transporte deve indicar o seu conteúdo diminuindo o risco de que este seja violado. Taxas de concepção com sêmen congelado IA intra vaginal: 0 a 60% IA intrauterina: 46 a 83% Transporte do sêmen refrigerado Soluciona problemas de distância entre a Matriz e o Reprodutor, possibilita várias inseminações em um mesmo ciclo com uma coleta de sêmen, além disso, mais de uma cadela pode ser inseminada com uma mesma remessa de sêmen. Amplia a diversidade racial e familiar em uma região longínqua do país, evita a quarentena e diminui o contágio de doenças, possibilita o transporte de sêmen de animais de cativeiro entre zoológicos. Possibilita remessa de sêmen para análise em centros distantes de onde se encontra o macho Identificação para o transporte do sêmen Os tubos de transporte devem ser devidamente marcados com: Doador (nome do certificado), raça, diluidor utilizado, data e hora da coleta, local da coleta e veterinário responsável (O Veterinário responsável pela refrigeração deverá expedir um relatório detalhado do processo de refrigeração, facilitando, desta forma, a correta utilização do sêmen pelo Veterinário que realizará as Ias). Exigências do CBKC para o transporte sêmen (confederação Brasileira de Cinofilia) O doador de sêmen e a matriz deverão atender as exigências genéticas, zootécnicas, sanitárias (Brucelose e Leptospirose com validade de 30 dias) , andrológicas e de identificação segundo o CBKC. O doador e a matriz devem ter certificado de DNA expedido por laboratório credenciado pelo CBKC. Intravaginal: Sêmen puro ou fresco, sêmen refrigerado ou sêmen de boa qualidade. Materiais: Pipeta de inseminação (bovinos), luvas, garrote e seringa de 5 ou 10 ml. Intra-uterina: Sêmen congelado e sêmen de qualidade inferior. Cateterização cervical: Material usado o cateter norueguês. Cistoscópio: Exame endoscópio das vias urinárias baixas. Laparoscopia: Feito um corte na região do abdômen com o objetivo de observar os órgãos e identificar a causa de determinado sintoma ou alteração em exames de imagem. Biotécnicas masculinas: A colheita é feita por excitação manual, vagina artificial, eletroejaculação e sêmen epididimário. Avaliação: Semen apto tem motilidade maior que 70% com vigor menor que 3. Inseminação artificial pode ser com sêmen fresco, resfriado, congelado. Diluição e refrigeração: Centrifugação 500rmp em 5 min, ressuspensão em diluidor (gemacitrato) e refrigeração banho-maria por 1h a 5o C (37o C ao 5o C). Congelação: Adição do diluidor com crioprotetor (glicerol), estabilização por 1h, envase, vapor N2L por 20minutos e raqueamento e armazenamento. Descongelação: Banho maria a 37º C por 30 segundos. Manejo O manejo da fêmea inclui todas as práticas necessárias para conseguir o máximo de leitões sadios e vigorosos com menor custo de produção. Sendo a inseminação artificial um aprimoramento das técnicas convencionais. Alimentação A alimentação é vital para que os animais possam desempenhar suas funções reprodutivas. É importante fornecer uma ração que esteja em perfeito equilíbrio de nutrientes. Uma alimentação exagerada e/ou desbalanceada pode levar ao acúmulo de gordura nos ovários, prejudicando a função reprodutiva da fêmea. A alimentação também deve ser controlada para evitar que as fêmeas cheguem ao parto com excesso de peso, pois isto pode resultar em maiores problemas durante o parto, maior risco de infecções uterinas e o aumento do intervalo entra desmama e cio. Idade A idade do animal é outro fator que deve ser levado em consideração. As leitoas apresentam o primeiro cio aos cinco ou seis meses de idade, porém, não devem ser inseminadas antes do sétimo ou oitavo mês, ocasião em que estarão pesando cerca de 130 a 140 kg em média, dependendo é claro da genética da fêmea, se manejadas corretamente, quando estarão apresentando o terceiro cio. Instalações A prática da inseminação ar9ficial não requer salas especiais, pois a fêmea no cio apresenta- se bastante dócil e de fácil manuseio. O produtor pode utilizar uma baia, que deve estar devidamente limpa ou a própria gaiola de gestação para realizar a inseminação. Higiene A prática da boa higiene é um dos fatores de maior importância em todo o processo de inseminação. O material a ser utilizado, bem como os órgãos genitais da fêmea devem estar limpos, para evitar a entrada de microrganismos, prevenindo assim o aparecimento de infecções intrauterinas. A exploração animal para ser econômica, antes de tudo, é preciso que seja bem organizada. O controle dos animais fica facilitado com a utilização de fichas individuais, nas quais devem ser registradas o máximo de informações possíveis sobre cada animal. Essas fichas são de real importância para o produtor, auxiliando- o na organização das inseminações, na avaliação da fecundidade das fêmeas e taxas de fertilidade da criação, e no descarte de fêmeas improdutivas. Formas de utilização do sêmen Sêmen fresco: Utilizado dentro de duas horas após a coleta. Sêmen resfriado/refrigerado: Utilizado no máximo por quatro a seis dias após a coleta e conservação em temperaturas de 14 a 17 °C, sendo recomendada a sua utilização por no máximo três dias. Sêmen congelado: Ilimitada capacidade de conservação (a técnica de congelamento que ocasiona isso), podendo ser transportado por longas distâncias. Identificação de fêmeas nos cio Sinais visíveis no pré-cio: Agitação, tentativa de monta, corrimento vulvar aquoso, ato de morder as barras da gaiola, emissão de grunhidos, vulva inchada e avermelhada. Sinais visíveis durante o cio: Orelhas levantadas, urina frequente, perda do apetite, olhar brilhante, excitação e emissão de grunhidos. Monta nas companheiras e se deixa montar por elas, procura ao cachaço quando ele está por perto, lombo arqueado, cauda levantada e balançando para cima e para baixo. Descarga vulvar de muco claro (corrimento vaginal), fica imóvel na presença do cachaço, fica imóvel se pressionada na região do dorso-lombar e fica imóvel ao ser cavalgada pelo homem.Avaliação sêmen Excitação mecânica: Fração pré-espermática: Translúcida. Fração rica em espermatozoide: Esbranquiçada e opaca. Fração pós-espermática: Translúcida com gel. Poliéstrica não-estacional Duração: 21 dias (18 a 24 dias). Fase folicular: 4 a 5 dias. Proestro: 1 a 3 dias. Estro: 48 a 72 horas. Fase lútea: 15 a 17 dias. Ovulação: 35 a 45 horas após o início do estro. Avaliação macroscópica Volume: 250ml. Cor: Esbranquiçada. Concentração: 200 – 300 x 106 sptz/ml. Fresco, refrigerado, congelado. Avaliação microscópica Motilidade ≥ 80 % Vigor - 3 Protocolo para a IA em suínos Detecção do cio: 12 horas após os primeiros sinais de cio, 12 horas após a primeira IA e 12 horas após a 2º IA (se a fêmea ainda aceitar). Parâmetros seminais e técnica de inseminação artificial Desvantagens inseminação: Duração das doses, estruturais laboratoriais e qualificação da equipe. Vantagens inseminação: Cuidados higiênicos, qualidade do sêmen, segurança sanitária, genética superior, redução de custos, alojar mais fêmeas e redução de macho. Peso dos leitões 13,16 leitões. Motilidade pós desmame Meta 5%, uma semana pós parto. Coleta de sêmen Método da VA (vagina artificial). Higienização do garanhão e da VA. Lubrificantes na VA. Filtros. Observação: Cuidado com choque térmico! Características do sêmen Volume: 25 a 150 ml (75ml). Coloração: Branco acinzentado. Motilidade: 40 a 80%. Vigor: 3. Concentração: 50 a 400 milhões sptz/ml. Métodos de utilização do sêmen Fresco: Tem vantagens como a redução dos custos e as desvantagens como a perda rápida da viabilidade. Diluído refrigerado: Leite desnatado, glicose, bicarbonato de sódio, gentamicina e água bidestilada. Tem vantagens em questão as melhorias na qualidade do sêmen e transporte. Deve ser refrigerado entre 5º C (48h) ou 15º C (24h). Congelado: Resfriamento em -196º C e descongelação em 46ºC por 20 segundos. Etapas da inseminação artificial Identificação das fêmeas em cio, descongelação do sêmen, reparo da palheta e do aplicador, contenção da égua e isolamento da cauda, higienização do reto e região perivulvar, localização da cérvix, deposição do sêmen e massagem clitoriana. Momento ideal para inseminação artificial Duração do estro: Em média 7 dias. Ovulação: 24 a 48h antes do fim do estro com acompanhamento ultrassonográfico (Folículo deve apresentar 35mm a 40mm e hCG ovulação 36 a 40h após aplicação). Sêmen fresco: 12 a 24h antes da ovulação e 12h após a ovulação. Sêmen congelado: 6 a 12h antes da ovulação e 6h depois da ovulação. Embriões de fêmeas doadoras são reimplantados em fêmeas receptoras Vantagens: Aumenta a progênie de fêmeas de alto valor genético, uniformização dos animais, comércio de embriões, controle de transmissão de doenças, produção de gêmeos e conservação de espécies em expanção. Desvantagens: Momento e local de transferência no trato genital, custo elevado e treinamento. Indicação: Éguas em competição, muito jovens ou muito idosas, problemas reprodutivos e não reprodutivos e pesquisa. Seleção de fêmeas Egua doaradora: Histórico reprodutivo, fertilidade e genitores, comportamento reprodutivo, valor potencial do potro resultante, número de gestações desejadas e resposta a sincronização e superovulação. Égua receptora: A própria seleção e manejo das éguas receptoras pode ser o fator mais importante que afeta o sucesso do programa de TE já que esta irá reconhecer o embrião e terá que fornece as condições necessárias ao seu desenvolvimento. 400 a 550k, 3 a 10 anos, bom desenvolvimento mamário, ciclicidade, livre de alterações uterinas e ovariana, palpação e US, 2 receptoras / doadora; Os tipos de receptoras são Égua inteira, Égua ovariectomizada tratada hormonalmente e Égua não cíclica tratada hormonalmente. Superovulação Anatomia do ovário com problema, localizado na fossa ovulatória, única região do ovário onde ocorrem as ovulações nas éguas. FSH e EPE (extrato de pituitária equina), iniciar tratamento com folículo de 23 a 25mm. Os protocolos usualmente utilizados são baseados na administração de 12 mg de FSH-e duas vezes ao dia, resultando em taxas de 3,4 a 5,2 ovulações por égua. De 170 éguas tratadas com EPE, foi obtida uma média de 3.2 ovulações e foram recuperados 1.96 embriões por égua, contrastando com o grupo não tratado que recuperou apenas 0.65 embrião por égua. Sincronização do estro e ovulação • A principal aplicação da sincronização do estro e da ovulação em éguas é na transferência de embriões, quando a ovulação da égua receptora deve ocorrer um dia antes a dois dias após a ovulação da égua doadora. • Um dos protocolos mais recomendados consiste na administração de progesterona de curta ação (150 mg) e de 17-β Estradiol (10 mg), por 10 dias consecutivos, com uma aplicação de PGF2α no 10o dia e uma de hCG (2500 UI) quando um folículo de 35 mm for detectado. Com este protocolo, 70% das éguas ovulam entre 10 a 12 dias após a última injeção do esteroide. Possíveis protocolos: Progestágenos, estrógenos, PGF2alfa, hCG, GnRH. IMPORTANTE: US + hCG ou GnRH. Tabela de avalição dos embriões Critério de classificação do grau de qualidade dos embriões. Envase em palhetas. Manutenção em temperatura ambiente por 2 a 3h. Resfriamento 5ºC e mantidos por 24h. Inovulação não cirúrgica Avaliação das receptoras, P4 aspectos da cérvix e útero, preenchimento da pipeta, evitar contato da pipeta com vulva ou vagina, passagem cervical, deposição do embrião no útero, D5 da receptora e diagnóstico de gestação 13 dias após ovulação. Freemartinismo Espécies: Bovinos, ovinos, caprinos, suínos e equinos. Gestação gemelar de fetos heterossexuais (anastomose 30-50d). O feto de cromossomos XY (macho) começa a secretar o hormônio masculino testosterona na corrente sanguínea (inibe o desenvolvimento genital do feto feminino). Transfusão de células germinativas do feto masculino (XY) para o feto feminino (XX), produzindo assim um quimerismo XX/XY. Inibe o desenvolvimento do trato genital. Nesses casos, as chances de essa fêmea não reproduzir, ser estéril, são grandes, entre 90% e 95%. Problemas: Masculinização da fêmea (hipertrofia de clitóris, vulva com pelos longos, vagina curta e em fundo cego, ausência de cérvix, testículos vestigiais, ausência de cio, esterilidade) e nos macho a fertilidade reduzida com a idade. Diagnóstico: Cariotipagem (quimerismo XX/XY) e PCR. Hemafroditismo Espécies: Bovino, caprinos, ovinos e suínos. Dois sexos anatômica e funcionalmente. Classificação: Hermafrodita verdadeiro (Tecido ovariano e testicular em gônadas separadas ou em uma só) ou Pseudo hermafrodita (A genitália externa tem características ambíguas, mas ambos os órgãos são testículos ou ovários). Diagnóstico: Palpação retal, US, Vaginoscopia, cariotipagem e PCR. Impotência coendi Capacidade fecundante com incapacidade de realizar a cópula, ausência de libido (desgaste sexual, alimentação deficiente, mudança de ambiente, dor). Alterações do prepúcio (balanopostites, aderências, neoplasias) e alterações penianas (hematomas, neoplasias). Impotência Generandi Incapacidade de gerar prole, após cobrição normal, alterações do ejaculado (aspermia,azoospermia, oligospermia, necrospermia), alterações do testículo (degeneração, orquite, hipoplasia, criptorquidismo), epidídimo, glândulas acessórias. Degeneração testicular Processo que compromete toda a linhagem seminal (Espermatogônia até sptz). Causas: Aumento da temperatura testicular (temperatura ambiente, hipertermia ou febre, processos inflamatórios do escroto ou testículo), traumas, torção do cordão espermático, idade e genética. Manifestações clínicas: Variável, baixa fertilidade com manutenção do comportamento sexual, flacidez testicular, fibrose e calcificação, alterações no Espermiograma, diminuição da motilidade e sptz, patologias de cabeça, cabeça sem cauda, defeitos de cauda, gotas citoplasmáticas proximais (acima de 40% diminuem fertilidade). Tratamento: Correção da causa, descanso sexual, melhora na alimentação e tempo de recuperação (3 a 6 meses). Fimose Inabilidade de expor o pênis através do prepúcio, congênita (rara). Adquirida: Traumatismo, cicatriz, neoplasia ou infecção. Manifestações clínicas: Obstrução do fluxo urinário, edema prepucial, balanopostites, dor e diminuição da libido. Manejo do paciente: Esvaziamento prepucial, lavagem prepucial, compressas e Atb. Tratamento: Prepucioplastia. Parafimose Inabilidade em retrair o pênis através do prepúcio. Secundária: Traumatismos, hematomas, neoplasias, corpo estranho, balanopostite crônica, baralisia MRP e alteração congênita. Tratamento (clínico até 24 horas): Solução fisiológica, lubrificantes e açúcar, acepromazina, reposionamento, atb e aines. Tratamento emergencial (Mais de 24 horas): Cirúrgico, tempo e grau de lesão peniana. Tratamento: Prepucioplastia, amputação peniana. Evitar: Manejo pré e pós acasalamento, orquiectomia e Prepucioplastia. Orquite / Epidimite Espécies: Bovinos, ovinos e cães. Transmissão durante acasalamento de origem viral causada pelo BoHV -1. Diagnóstico: Palpação e leucospermia. Tratamento: ATB e afastar animal da reprodução. Hiperplasia prostática benigna Espécie: 80% Cães de meia idade. Processo decorrente de alterações hormonais e envelhecimento do animal, envelhecimento ( sensibilidade testosterona), aumento dos receptores hormonais(DHT). Tratamento: Orquiectomia bilateral (70%), inibidores da 5a-reductase (enzima que converte a testosterona, o hormônio sexual masculino, em um outro mais potente, a di- hidrotestosterona o DTH), laxantes e descompressão vesical. Obtenção de embriões viáveis a partir de fêmeas saudáveis de alto valor genético e também aquelas que não estão mais aptas a produzirem descendentes pelas técnicas convencionais. Fêmeas a partir dos seis meses de idade, gestantes até o terceiro mês ou no período pós- parto podem ser usadas como doadoras de oócitos na PIV. Vantagens: Possibilita a utilização de bezerras pré-púberes, vacas em início de gestação, vacas com subfertilidade adquirida, vacas senis e vacas mortas acidentalmente, não é necessário o uso de hormônios para a recuperação dos oócitos, aumentando a vida reprodutiva das doadoras e diminuindo o intervalo de produção dos embriões. Produção de cerca de 36 bezerros por ano a partir de uma única fêmea, avanço na multiplicação de fêmeas bovinas de interesse para a produção animal e para a conservação de raças de animais domésticos ameaçadas de extinção. Facilita o uso e aprimoramento de técnicas avançadas de reprodução animal, como clonagem, injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e transgenia. Permite otimizar o uso de sêmen de reprodutores alto valor genético e de sêmen sexado, produção de embriões com grau de sangue e sexo definidos para atender a programas específicos de produção (leite e carne), em larga escala e com menor custo. Animais vivos: Permite a colheita de oócitos em fêmeas pré-púberes, senis ou mesmo prenhes. Torna possível repetir a colheita várias vezes no mesmo animal, tornando viável o uso do termo “doadora permanente”. OPU Aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, pode ser realizada em qualquer fase do ciclo, equipamento específico, 8 oócitos recuperados. (Pode ser duas vezes por semana ou uma vez, ou uma vez a cada quinze dias). Colheita guiada por laparoscopia Pode ser realizada sem ou com estímulo hormonal anterior, somente com uso de tratamento hormonal de estimulação ovariana, o método torna-se interessante para obter-se um número adequado de oócitos. Protocolo hormonal de estimulação ovariana Efeito de diferentes tratamentos hormonais de estimulação ovariana sobre o número de folículos visualizados, aspirados e a taxa de colheita oocitária: Ovários de abatedouro Pesquisa, transporte em NACL 0,9% 30 a 35ºC (3 Horas). 6 a 10 oócitos recuperados, aspiração e dissecação. Métodos de colheita: Slicing e punção folicular. Ovocitação Avaliação dos oócitos Qualidade um: Cumulus compacto presente com mais de três camadas celulares, ooplasma com granulações finais e homogêneas, preenchendo a zona pelúcia e de coloração marrom. Qualidade dois: Cumulus compacto, parcialmente presente em volta do oócito ou rodeando completamente o oócito, com menos de três camadas celulares, ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentradas no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local que apresenta mancha escura o ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida. Qualidade três: Cumulus presente, expandido, ooplasma contraído com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço perivitelino, degenerando vacuolizando ou fragmentando. Qualidade quatro: Oócito desnudo (Sem cumulus). Duração: 22 a 24 horas. Maturação citoplasmática e nuclear, diplóteno da primeira prófase, meiótica até a metáfase II. Modificações no número, tamanho e posições de organelas citoplasmáticas, expansão de células cumulus. Maturação completa com capacidade do oócito em ser fecundado e desenvolver um embrião. Meios de maturação: TCM com sais de EARLE, gonadotrofinas, fonte energética como glicose e piruvato, fonte de proteína, SFB, estufa 39ºC, atmosfera 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Separação espermática: Rápida, simples, baixo custo, recupera sptz móveis, remove sptz mortos e outras células, remove substâncias tóxicas. Gradiente de percol: Partículas de sílica coloidal coberto com polivinilpirrolidona, preparado com diferentes concentrações. Captação espermática e oócitária: 18 e 22 horas, meio FERT-TALP, temperatura 39ºC, atmosfera de 5% de CO2 e 2x106 sptz/ML. Oócitos maturados Remoção da células do cumulus, lavagem dos oócitos em meio FIV, SOF + soro de cabra em estro . Preparo do sêmen: Sêmen congelado/descongelado, gradiente de percoll (45%/90%) 10 min a 900 g e interação sptz/oócitos com tempo de 18 horas. Cultivo in vitro de embriões Co-cultivo: 7 dias e meio SOF (Fluído da tuba uterina de bovinos).
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