Relatório 2 - Prática de química dos alimentos

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Introdução
A invertase (também conhecida como sacarase) é uma enzima catalítica capaz de catalisar a hidrólise da sacarose em frutose e glicose, geralmente na forma de xarope de açúcar invertido. No uso industrial a invertase é, geralmente, obtida a partir de leveduras (Saccharomyces cerevisiae, por exemplo). Pode-se medir a velocidade da reação catalisada pela formação de açúcares redutores (glicose e frutose) em experimentos com condições diferentes e com mesma quantidade de tempo. Tais reações devem ser interrompidas após o tempo fixo, que deve ser rigorosamente cronometrado, com o uso do reagente R, o qual tem como função a desnaturação da enzima (a mesma é inibida por tal reagente R) e atua como agente oxidante na reação com os açúcares redutores formados. Sabe-se que a quantidade de sacarose hidrolisada é igual à quantidade de glicose e frutose produzidas. Isto pode ser medido a partir do espectrofotômetro com comprimento de onda de 540 nm. Quando é reagido glicose e frutose com o reagente R, a reação apresenta uma coloração avermelhada, e o reagente R no estado oxidado possui coloração amarela. A partir disso, é necessário que se tenha uma curva padrão feita com uma solução padrão de glicose de concentração conhecida para poder realizar a conversão de absorbância (em micromoles) de sacarose hidrolisada. 
Objetivo
	O objetivo desta prática é estudar propriedades catalíticas da enzima invertase a partir de experimentos envolvendo alterações nas concentrações de enzima, substrato, tampão, alterações de temperatura e tempo definido.
Materiais e Métodos
Parte experimental
1. Obtenção da reta de calibração: O estudo da cinética enzimática, nos próximos experimentos, requer o reconhecimento da concentração dos produtos formados na reação, que são açúcares redutores. Para tanto, vamos determinar inicialmente a absorbância a 540 nm, de soluções contendo diferentes concentrações de glicose após sua reação com reagente R. A reta de calibração vai permitir transformamos os valores de absorbância em concentração de açúcares redutores liberados, que representam o produto liberado.
1.1 Preparar uma série de 6 tubos de ensaio. Pipetar cuidadosamente a solução padrão de glicose 0,01 M, seguindo a tabela abaixo.
	Tubos 
	Glicose 0,01 M (mL)
	Água(mL)
	Reagente R
	Banho Maria
	Água (mL)
	Branco 
	0
	1
	1
	5
	8
	1
	0,2
	0,8
	1
	5
	8
	2
	0,4
	0,6
	1
	5
	8
	3
	0,6
	0,4
	1
	5
	8
	4
	0,8
	0,2
	1
	5
	8
	5
	1
	0
	1
	5
	8
1.2 Acrescentar 1 mL de reagente R. Colocar os tubos em banho de água fervente por 5 min cronometrados. Resfriar os tubos, completar o volume para 10 mL com água destilada conforme indicado e ler a absorbância em 540 nm.
2. Propriedades catalíticas da invertase 
2.1 Análise da concentração da enzima:
Material necessário:
a) Solução de sacarose (substrato) 0.3 M em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7.
b) Solução de invertase (enzima), em tampão acetato 0,05 M, pH 4,7.
c) Tampão acetato 0,05 M, pH 4,7.
	Tubos
	Enzima (mL)
	Tampão (mL)
	Substrato (mL)
	Incubar
	Reagente R(mL)
	Banho Maria
	Água (mL)
	Branco 
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	1
	0,2
	0,3
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	2
	0,3
	0,2
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	3
	0,4
	0,1
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	4
	0,5
	0
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
2.2 Velocidade enzimática versus temperatura 
Neste experimento a ação enzimática é observada em diferentes temperaturas.
	Tubo
	Temp (ºC)
	Tampão (mL)
	Enzima (mL)
	Substrato
(mL)
	Incubar
	Reagente
R (mL)
	Banho Maria
	Água
(mL)
	Branco
	
	0,5
	0
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	1
	0
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	2
	Ambiente
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	3
	60
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
	4
	96
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	8
Incubar todos os tubos nas temperaturas determinadas, durante 5 min cronometrados, iniciando a contagem do tempo após a adição do substrato. Parar a reação acrescentando 1 mL do reagente R em cada tubo, e colocá-los em banho de água fervente por 5 min. Acrescente 8 mL de água destilada em cada tubo e ler a 540 nm.
2.3 Determinação de Vmax e Km da invertase
	Tubo
	Enzima (mL)
	Tampão (mL)
	Substrato
(mL)
	Incubar
	Reagente
R (mL)
	Banho 
Maria
	Água
(mL)
	Branco
	0
	0
	1
	5 min
	1
	5 min
	7
	1
	1
	0,1
	0,1
	5 min
	1
	5 min
	7
	2
	1
	0,2
	0,2
	5 min
	1
	5 min
	7
	3
	1
	0,3
	0,3
	5 min
	1
	5 min
	7
	4
	1
	0,4
	0,4
	5 min
	1
	5 min
	7
	5
	1
	0,5
	0,5
	5 min
	1
	5 min
	7
	6
	1
	0,6
	0,6
	5 min
	1
	5 min
	7
	7
	1
	0,7
	0,7
	5 min
	1
	5 min
	7
	8
	1
	0,8
	0,8
	5 min
	1
	5 min
	7
	9
	1
	1
	1
	5 min
	1
	5 min
	7
Resultados e Discussão
1. Obtenção da reta de calibração: 
	Em 6 tubos de ensaio foram adicionados diferentes volumes de glicose, água e 1 mL do reagente R preparado previamente em todos os tubos. Os tubos foram colocados em banho maria fervente por 5 min. Após esse tempo, foram adicionados 8 mL de água em todos os tubos e posteriormente leu-se a absorbância dos tudos em 540 nm. Os resultados estão na Tabela 1:
Tabela 1: Valores das absorbâncias obtidas
	Tubos
	Glicose 0,01M (mL)
	Água (mL)
	Reagente R
	Banho maria
	Água (mL)
	Abs 540 nm
	Branco
	0,0
	1,0
	1,0
	5 min
	8,0
	0,00 abs
	1
	0,2
	0,8
	1,0
	5 min
	8,0
	0,234 abs
	2
	0,4
	0,6
	1,0
	5 min
	8,0
	0,450 abs
	3
	0,6
	0,4
	1,0
	5 min
	8,0
	0,736 abs
	4
	0,8
	0,2
	1,0
	5 min
	8,0
	1,019 abs
	5
	1,0
	0,0
	1,0
	5 min
	8,0
	1,218 abs
	Percebe-se que è medida em que à medida em que a concentração de glicose aumenta a coloração dos tubos vai se tornando mais intensa, como é possível observar na Figura 1, e consequentemente apresenta um maior valor de absorbância.
Figura 1: Coloração nos tubos com diferentes quantidades de glicose 0,01 M
Calculando a velocidade inicial (Vo) a partir das leituras de abs obtidas em cada experimento:
Um gráfico da absorbância versus o número de de mols de glicose em cada tubo será contruído.
Convertendo a quantidade em mL de glicose 0,01M para mols através da regra de três:
Tabea 2: Cálculo no número de mols de glicose 0,1 M
	Tubo 1:
0,01M--> 1000 mL
N ----> 0,2 mL
 
N = 0,000002
N = 2x10-6
	Tubo 2:
0,01M--> 1000 mL
N ----> 0,4 mL
 
N = 0,000004
N = 4x10-6
	Tubo 3:
0,01M--> 1000 mL
N ----> 0,6 mL
 
N = 0,000006
N = 6x10-6
	Tubo 4:
0,01M--> 1000 mL
N ----> 0,8 mL
 
N = 0,000008
N = 8x10-6
	Tubo 5:
0,01M--> 1000 mL
N ----> 1,0 mL
 
N = 0,00001
N = 1x10-5
A partir desses valores e dos resultados da absorbância obtidos, foi construído o gráfico:
2. Propriedades catalíticas da invertase
2.1. Análise da concentração de enzima:
	Nesse experimento em cada tubo de ensaio colocou-se diferentes volumes da Enzima (solução de invertase), de tampão acetato e 0,5 mL de solução de sacarose (substrato). Incubou-se por 5 min, adicionou-se 1 mL de reagente em todos os tubos, colocou-se em banho maria por 5 min e transcorrido esse tempo colocou-se 0,5 mL de água nos tubos. Em seguida, mediu-se a absorbância, que pode ser vista na Tabela 2:
Tabela 3: Valores das absorbâncias obtidas
	Tubos
	Enzima (mL)
	Tampão (mL)
	Substrato (mL)
	Incubar
	Reag. R (mL)
	Banho Maria
	Água (mL)
	Abs 540 nm
	Branco
	0,0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,00 abs
	1
	0,2
	0,3
	0,5
	5min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,250 abs
	2
	0,3
	0,2
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,643 abs
	3
	0,4
	0,1
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,671 abs
	4
	0,5
	0,0
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,850 abs
Calculado a velocidade inicial (Vo) a partir das leituras de abs obtidas em cada experimento:
Tubo 1:
0,250=12472 x – 0,014
12472 x=0,264
X= 2,117 x 10-5 mols
V0=2,117 x 10-5mols =4,2334 x 10-6 mols/min=4,2334 µmols/min
 5 min
Tubo 2:
0,643=12472 x – 0,014
12472 x= 0,657 
X= 5,268 x 10-5 mols
V0=5,268 x 10-5 mols= 1,0535 x 10-5 mols/min = 10,535 µmols/min
 5 min 
Tubo 3:
0,671= 12472 x – 0,014
12472 x= 0,685
X= 5,4923 x 10-5 mols
V0= 5,4923 x 10-5 mols= 1,0984 x 10-5 mols/min= 10,984 µmols/min
5 min 
Tubo 4:
0,850= 12472 x-0,014 
12472 x= 0,864
X= 6,9275 x 10-5 mols
X= 1,6565 x 10-5 mols= 1,3854 x 10-5 mols/min= 13,854 µmols/min
	5 min
Tabela 4: Volume da enzimae Velocidade
	Tubo 
	Volume de enzima
	Velocidade 
	1
	2,117 x 10-5 mols
	4,2334 µmols/min
	2
	5,268 x 10-5 mols
	10,535 µmols/min
	3
	5,4923 x 10-5 mols
	10,984 µmols/min
	4
	6,9275 x 10-5 mols
	13,854 µmols/min
Foi feito um gráfico Faça do Volume de enzima e a Velocidade.
	Analisando o gráfico, podemos dizer que para uma mesma quantidade de substrato nos quatro tubos, quando aumentamos o volume de enzima, a velocidade da reação aumenta, uma vez que a quantidade de sítios ativos para que a reação ocorra aumenta, aumentando as chances de formação de produto (substrato ligado ao sitio ativo da enzima) e por consequência a velocidade da reação.
2.2. Velocidade enzimática versus temperatura
	Nos tubos de ensaio, a diferentes temperaturas, foram colocados quantidades de tampão, enzima substrato e incubados por 5 min. Posteriormente, adicionou-se a mesma quantidade do reagente R em todos os tubos, colocou-se em banho maria, adicionou-se 0,8 mL de água e mediu-se a absorbância.
Tabela 5: Valores das absorbâncias obtidas
	Tubo
	Temp (oC)
	Tampão (mL)
	Enzima (mL)
	Substrato (mL)
	Incubar
	Reag. R
	Banho Maria
	Água (mL)
	Abs 540 nm
	Branco
	
	0,5
	0
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,000
	1
	0
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,306
	2
	Ambiente
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,922
	3
	60
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	3,080
	4
	96
	0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	8,0
	0,208
Calculado a velocidade inicial (Vo) a partir das leituras de abs obtidas em cada experimento
· Tubo 1:
Absorbåncia= 0,306
0,306 = 12472x – 0,014
x = 2,567x10-5 mols
V0= 2,567 x 10-5mols = 0,513 x 10-6 mols/min= 5,13 µmols/min
 5 min
· Tubo 2:
Absorbåncia= 0,922
0,922 = 12472x – 0,014
x = 7,50 x10-5 mols
V0= 7,50 x 10-5mols = 1,5 x 10-5 mols/min= 15 µmols/min
 5 min
· Tubo 3:
Absorbåncia= 3,280
3,280 = 12472x – 0,014
x = 2,64x10-4 mols
V0= 2,64 x 10-4mols = 0,528 x 10-4 mols/min= 52,8 µmols/min
 5 min
· Tubo 4:
Absorbåncia= 0,208
0,208 = 12472x – 0,014
x =1,78 x10-5 mols
V0= 1,78 x 10-5mols = 3,56 x 10-6 mols/min= 3,56 µmols/min
 5 min
 Tabela 6: Volume da enzima e velocidade
	Tubo 
	Volume de enzima
	Velocidade 
	1
	2,567x10-5mols
	5,13 µmols/min
	2
	7,50 x10-5 mols
	15 µmols/min
	3
	2,64x10-4 mols
	52,8 µmols/min
	4
	1,78 x10-5 mols
	3,56 µmols/min
Um gráfico da temperatura e a velocidade foi construído.
	Obsrevando a coloração dos tubos de ensaio e o gráfico, pode-se dizer que a enzima possui melhor atividade na temperatura de 60 °C e atividade mais baixa na temperatura de 0 °C, pois, a velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura. 
	Porém, a partir de uma determinada temperatura, a velocidade da reação diminui. O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e, portanto, maiores possibilidades de elas se chocarem para reagir. No entanto, se for ultrapassada certa temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.
	Nesse caso, a tempetarura de 60ºC foi um ótimo para a atividade da enzima, mas em casos de baixa e altua temperatura, a atividade da enzima é inibida.
2.3. Determinação de Vmax e Km da invertase
	Nos tubos, foram colocados quantidades de enzima, solução tampão, substrato e incubou-se por 5 min. Adicionou-se o Reagente R e colocou-se em banho maria por 5 min acrescentando água depois. Mediu-se a absorbância.
Tabela 6: Valores das absorbâncias obtidas
	Tubo
	Enzima (mL)
	Tampão (mL)
	Substrato (mL)
	Incubar
	Reag. R (mL)
	Banho Maria
	Água (mL)
	Abs 540 nm
	Branco
	0,0
	0,0
	1,0
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	0,000 abs
	1
	1,0
	0,9
	0,1
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	0,099 abs
	2
	1,0
	0,8
	0,2
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	0,837 abs
	3
	1,0
	0,7
	0,3
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,122 abs
	4
	1,0
	0,6
	0,4
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	0,784 abs
	5
	1,0
	0,5
	0,5
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,241 abs
	6
	1,0
	0,4
	0,6
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,283 abs
	7
	1,0
	0,3
	0,7
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,251 abs
	8
	1,0
	0,2
	0,8
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,258 abs
	9
	1,0
	0,0
	1,0
	5 min
	1,0
	5 min
	7,0
	1,050 abs
Calculado a velocidade inicial (Vo) a partir das leituras de abs obtidas em cada experimento
Tubo 1:
0,099=12472 x – 0,014
12472 x=0,0,113
X= 9,0603 x 10-5 mols
V0=9,0603 x 10-5mols =4,8120 x 10-6 mols/min=4,8120 µmols/min
 5 min
Tubo 2:
0,837=12472 x – 0,014
12472 x=0,851
X= 6,8238 x 10-5 mols
V0=6,8238x 10-5mols =1,3646 x 10-5 mols/min=13,646 µmols/min
 5 min
Tubo 3:
1.122=12472 x – 0,014
12472 x=1,136
X= 9,1084 x 10-5 mols
V0=9,1084 x 10-5mols =1,8217 x 10-5 mols/min= 18,217µmols/min
 5 min
Tubo 4:
0,784=12472 x – 0,014
12472 x=0,798
X= 6,3983 x 10-5 mols
V0=6,3983 x 10-5mols =1,2797 x 10-5 mols/min= 12,797µmols/min
 5 min
Tubo 5:
1,241=12472 x – 0,014
12472 x=1,255
X= 1,0062 x 10-4 mols
V0=1,0062 x 10-5mols =2,0125x 10-6 mols/min=20,125 µmols/min
 5 min
Tubo 6:
1,283=12472 x – 0,014
12472 x=1,297
X= 1,0399 x 10-4 mols
V0=1,0399 x 10-4mols =2,0798 x 10-5 mols/min=20,798 µmols/min
 5 min
Tubo 7:
1,251=12472 x – 0,014
12472 x=1,265
X= 1,0143 x 10-4 mols
V0=1,0143 x 10-4mols =2,0285x 10-5 mols/min=20,285 µmols/min
 5 min
 Tubo 8:
1,258=12472 x – 0,014
12472 x=1,272
X= 1,0199 x 10-4 mols
V0=1,0199 x 10-4mols =2,0398 x 10-6 mols/min=20,398 µmols/min
 5 min
Tubo 9:
1,05=12472 x – 0,014
12472 x=1,064
X= 8,5311 x 10-5 mols
V0=8,5311 x 10-5mols =1,7062 x 10-6 mols/min=17,062 µmols/min
 5 min
Além disso, temos que calcular quanto de substrato, em µmols, foi adicionado aos tubos.
Obs.: Cf representa a concentração final do substrato de cada tubo e Vo o volume inicial.
· Tubo 1: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (1) x Vf
0,3 x 0,1 ml = Cf(1) x 10 ml Cf(1) = 3000 µmols.
· Tubo 2: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (2) x Vf
0,3 x 0,2 ml = Cf(2) x 10 ml Cf(2) = 6000 µmols.
· Tubo 3: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (3) x Vf
0,3 x 0,3 ml = Cf(3) x 10 ml Cf(3) = 9000 µmols.
· Tubo 4: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (4) x Vf
0,3 x 0,4 ml = Cf(4) x 10 ml Cf(4) = 12000 µmols.
· Tubo 5: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (5) x Vf
0,3 x 0,5 ml = Cf(5) x 10 ml Cf(5) = 15000 µmols.
· Tubo 6: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (6) x Vf
0,3 x 0,6 ml = Cf(6) x 10 ml Cf(6) = 18000 µmols.
· Tubo 7: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (7) x Vf
0,3 x 0,7 ml = Cf(7) x 10 ml Cf(7) = 21000 µmols.
· Tubo 8: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (8) x Vf
0,3 x 0,8 ml = Cf(8) x 10 ml Cf(8) = 24000 µmols.
· Tubo 9: Substrato (Sacarose) 0,3 M
Co x Vo = Cf (9) x Vf
0,3 x 1,0 ml = Cf(9) x 10 ml Cf(9) = 30000 µmols.
Tabels 7: Velocidade da reação e Concentração de sacarose
	Tubo 
	Velocidade de reação
	Concentração de sacarose
	1
	4,8120 µmols/min
	3000 µmols
	2
	13,646 µmols/min
	6000 µmols
	3
	18,217µmols/min
	9000 µmols
	4
	12,797µmols/min
	12000 µmols
	5
	20,125 µmols/min
	15000 µmols
	6
	20,798 µmols/min
	18000 µmols
	7
	20,285 µmols/min
	21000 µmols
	8
	20,398 µmols/min
	24000 µmols
	9
	17,062 µmols/min
	30000 µmols
Tabela 8: 1/velocidade de reação e 1/concentração de sacarose
	Tubo 
	1/velocidade de reação
	1/concentração de sacarose
	1
	0,2078
	3,3333 x 10-4
	2
	0,0732 
	1,6667 x 10-4
	3
	0,0549
	1,111 x 10-4
	4
	0,0781 
	8,3333 x 10-5
	5
	0,0497 
	6,6667 x 10-5
	6
	0,0480
	5,5555 x 10-5 
	7
	0,0493
	4,7619 x 10-5
	8
	0,0490
	4,1667 x 10-5
	9
	0,0586
	3,3333x10-5
Tabela 9: [S]/velocidade de reação e Concentração de sacarose
	Tubo 
	[S]/velocidade de reação
	Concentração de sacarose
	1
	623,4414
	3000 µmols
	2
	439,6893
	6000 µmols
	3
	494,0440
	9000 µmols
	4
	937,7198
	12000 µmols
	5
	745,3416
	15000 µmols
	6
	865,4678
	18000 µmols
	7
	1035,2477
	21000 µmols
	8
	1176,5859
	24000 µmols
	9
	1758,2933
	30000µmols
	Um gráfico hiperbólico de Michaelis-Menten da velocidade de reação versus concentração de sacarose foi construído.
	Analisando o gráfico, à medida que o ubstrato é adicionado, a velocidade da reação aumenta. Entretanto, num dado instante essa velocidade não aumenta mais, tornando-se, aproximando-se de uma constante. Isso ocorre pois nesse ponto a velocidade máxima é atingida, uma vez que conforme o substrato é adicionado, a enzima o converte na mesma proporção, mas se o substrato está em excesso, a enzima tende ao seu estado de saturação, processo que ocorre de forma lenta e gradual. Esse resultado também pode ser observado pela coloração dos tubos.
Para que os valores de Vmáx e Km sejam encontrados, constuiu-se o gráfico:
Através desse gráfico, obtivemos a equação: y = 0, 0001 x + 2,0x10-5.
Quando adotamos x = 0 e y = 0 obtemos os valores de 1/Vmáx e -1/Km, respectivamente.
· Cálculo de Vmáx:
y = 0,001x(0) + 2,0x10-5
y = 2,0x10-5
 1 = 2,0x10-5 Vmáx = 200000 µmols/minuto
Vmáx
· Cálculo de Km:
0 = 0,001x + 2,0x10-5
x = - 0,02
-1 = - 0,02 Km = 50
Km
Alternativamente, podemos usar o gráfico linear de Hanes-Wolf (quantidade de substrato/V versus concentração de substrato).
Quando adotamos x = 0 e y = 0 obtemos os valores de km/Vmáx e -Km, respectivamente.
· Cálculo de Km:
0 = 0,041 x + 257,6
x = - 6282,9
-Km = - 6282 Km = 6282
· Cálculo de Vmáx:
y = 0,041 x + 257,6
y = 257,6
 Km = Vmáx = 24386 µmols/minuto
Vmáx
	Assim, obtivemos os valores Vmáx e Km. O valor de Km estabelece a relação precisa entre a concentração de substrato e a velocidade da reação enzimática. Quanto menor o valor de Km, maior a afinidade da enzima pelo substrato, pois se necessita de uma menor concentração de substrato para que a enzima atinja a metade da Vmáx. Então, pelo valor calculado, podemos concluir que a afinidade da enzima pelo substrato é baixa.
Conclusão
	A partir dos resultados obtidos nos experimentos, podemos considerar que vários fatores influenciam na velocidade de uma reação, tais como quantidade de enzima, temperatura e quantidade de substrato. Observamos que para uma quantidade fixa de substrato, a velocidade a reação aumenta conforme se adiciona mais enzima. A temperatura influência a velocidade dentro de certos limites, pois está relacionada com o processo de desnaturação da enzima. Por fim, em termos de dependência da quantidade de substrato, a velocidade da reação é interpretada através dos gráficos de Michaelis-Menten e de Hanes-Wolf, que possibilitaram cálculos que apontaram uma baixa afinidade da enzima pelo substrato. 
Referências
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· ALMEIDA, Vanessa Vivian; CANESIN , Edmilson Antônio; SUZUKI, Rúbia Michele e PALIOTO,Graciana Freitas; Análise quantitativa de proteínas em alimentos por meio de reação de complexação do íon cúprico. Química Nova na Escola, p. 34-40, 2012.
· PATROCINIO, Daniele do Espírito Santo; Sensibilidade da protease de papaína de Carica papaya a agentes utilizados em técnicas de imobilização, Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Ciências e Letras – Assis/SP p 02486-02489.
· UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO; <www.ufpe.br/dbioq/portalbq04/arquivos/apostila%202007.doc> acessado em 16/11/2013.
· UNIVERSIDADES ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”; <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradastres.htm > acessado em 16/11/2013.
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