BIOLOGIA MOLECULAR - Estudo Dirigido V (1)

Prévia do material em texto

ESTUDO DIRIGIDO AULA V - BIOLOGIA MOLECULAR 
 Farmacêutica e Mestranda Daniele Fernanda Wille 
______________________________________________________________________________ 
 
1. A respeito da Hibridização, essa é uma técnica utilizada com a finalidade de rastrear, de maneira 
específica, uma determinada sequência de combinações entre os ácidos nucleicos do DNA. Ademais, é 
geralmente utilizada na determinação de da distância genética existente entre espécies diferentes. 
 
 2. Os tipos de sonda, bem como suas respectivas origens são: RNA, que são ondas advindas por 
intermédio das inserções de DNA em vetores, através da clonagem; DNA, as quais são originadas por 
amplificações de PCR e clonagem, tendo como base o DNA; Oligonucleotídeos, os quais podem ser 
obtidos a partir de síntese química. 
 
 3. São dois os tipos de sistemas de detecção das sondas, podendo ser radioativas ou não-radioativas. No 
que tange as radioativas, essas são as que nucleotídeos dotados de radioisótopos são incorporados nesta 
sonda, sendo detectados através da técnica de autorradiografia. Pode-se destacar como exemplos de 
radioisótopos, a saber, os fósforos 32 e 33, sendo o 32 o mais utilizado e o carbono 14. Além disso, no 
que diz respeito às sondas não-radioativas, pode-se constatar que são nucleotídeos dotados de moléculas 
ou substâncias que podem ser incorporadas na sonda, pois são detectadas com facilidade. Sobre 
exemplos, pode-se salientar a inserção de digoxigenina juntamente com um anticorpo específico para sua 
devida detecção e a inserção de fluoróforos - a saber, a fluoresceína e a rodamina. Ademais, métodos 
colorimétricos ou de quimioluminescência também permitem a efetiva detecção de sondas. 
 
 4. Sobre ambos os processos que marcam as sondas, assim como suas respectivas explicações, pode-se 
destacar o Nick translation, que acontece quando há a quebra da fita simples por intermédio da DNA 
polimerase, com adição de nucleotídeos marcados no lugar de nucleotídeos que existiam anteriormente, 
mas que não sofreram a marcação, a partir da da extremidade 3’ OH. Além disso, há a ação da 
exonuclease, que substitui esses nucleotídeos que não foram marcados. Ademais, o random printing 
também é um dos processos para marcar as sondas, no qual há a inserção de hexanucleotídeos como 
primers. Neste processo, a DNA polimerase I atuará apenas como uma polimerase, por intermédio da 
subunidade Klenov. Assim, uma nova fita será gerada com os nucleotídeos marcados e sem a ação da 
exonuclease. 
 
5. Acerca disso, constata-se que os ácidos nucleicos são apoiados em um um suporte sólido e que, após 
isso, são misturados com uma solução aquosa que possui sondas com nucleotídeos marcados - neste 
caso, pode ou não acontecer o processo de Hibridização, pois depende da complementariedade da base. 
Por conseguinte, são realizadas lavagens para remover o que não for a hibridizado. 
 
6. A respeito de Microarranjos de DNA, esses são conjuntos de milhares de sondas de DNA ou 
oligonucleotídeos que não foram marcadas, as quais encontram-se fixadas em locais específicos de uma 
determinada superfície. Ainda sobre esses Microarranjos, após a Hibridização, um scanner detecta o sinal 
emitido por cada ponto da mistura, que, consequentemente, será analisado e quantificado por um software 
de imagem. Quando não há Hibridização, o software demonstra a cor branca, enquanto a cor amarela é 
apresentada quando o trecho presente sofreu a Hibridização com as amostras X e Y. Enquanto isso, a 
coloração verde é apresentada quando apenas na amostra Y aconteceu o processo de Hibridização e, 
coloração vermelha quando apenas na amostra X. 
 
7. 
 1. ( b )Southern Blot 
 2. ( d )Northern Blot 
 3. ( c )Dot Blot 
4. ( a )Colony Blot 
 5. ( c )Slot Blot 
 6. ( c )Microarray 
 
8. Alternativa B. 
 
9. Alternativa D. 
 
10. 
 Molécula ou 
substância que 
deve ser 
identificada 
Preparação da 
amostra 
Sonda Método de 
detecção 
Southern Blotting DNA Purificação e 
digestão do DNA 
por enzimas de 
restrição. 
Fragmentos: 
separados em gel 
de agarose 
Nucleotídeo 
marcado por 
radioatividade ou 
por intermédio de 
moléculas 
capazes de serem 
detectadas 
Raio-X 
 
Nothern Blotting Extração de RNA 
e seu isolamento - 
não é digerido por 
enzimas de 
restrição. 
Nucleotídeo 
marcado por 
radioatividade ou 
por intermédio de 
moléculas 
Raio-X; 
Quimiolumi-
nescência 
 
Separação em gel 
de agarose 
capazes de serem 
detectadas 
Western Blotting Separação em gel 
de eletroforese 
Proteínas Anticorpos 
 
Hibridização em 
Dot Blot 
 Aplicação direta 
na membrana 
Oligonucleotídeos Anticorpos 
Colony Blot Preparação de 
placa de Ágar com 
colônia de 
bactérias 
individuais 
DNA Autorradiografia 
 
Hibridização in 
Situ 
 Utilização de 
lâmina com 
cromossomo, ou 
célula, ou tecido 
DNA ou RNA Autorradiografia