Biologia Molecular II - Resumo expandido - Cap 22 Biologia de Sistemas

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RESUMO EXPANDIDO DO CAPÍTULO 22 DO LIVRO “BIOLOGIA
MOLECULAR DO GENE”: BIOLOGIA DE SISTEMAS
Biologia Molecular do Gene - 7ª ed., 2015.
CAPÍTULO 22 - pg. 775 a 791
BIOLOGIA DE SISTEMAS
Os rápidos e constantes progressos tecnológicos das últimas décadas
permitiram o advento de uma nova biologia molecular, capaz de identificar e
caracterizar cada componente de um processo celular complexo. Em
decorrência disso, há uma nova vertente que une a biologia molecular
experimental tradicional e a análise computacional: a biologia de sistemas.
As estratégias tradicionais, que investigavam mecanismos subjacentes de
sistemas relativamente simples, são substituídas por estratégias holísticas
que abordam sistemas mais complexos de organização biológica.
A biologia de sistemas descreve as propriedades das redes de
interações que controlam as funções dos organismos, a partir de uma
metodologia interdisciplinar, baseada em matemática, biologia molecular e
celular, engenharia, física e ciência da computação. Aplicando a biologia de
sistemas à biologia molecular do gene, o objetivo é revelar princípios dos
circuitos reguladores gênicos que não podem ser compreendidos a partir de
uma abordagem isolada dos seus componentes.
A biologia de sistemas associa-se diretamente à biologia sintética, a
qual objetiva, a partir da formulação de redes artificiais que mimetizam
circuitos reguladores gênicos, elucidar os princípios de tais circuitos. Além
disso, como a evolução é impulsionada muito mais pelas alterações das
redes de regulação gênica do que dos genes propriamente ditos, a biologia
de sistemas é de alto interesse para a compreensão da evolução.
CIRCUITOS REGULADORES
Os circuitos reguladores são redes simples constituídos por nós, os
quais representam os genes, e bordas, as quais representam a regulação de
um gene pelo produto de outro (Fig. 1-a). As bordas indicam a
direcionalidade da regulação e se esta é positiva ou negativa. Uma linha
terminando em “⊥” e partindo de A para B, por exemplo, indica uma
regulação negativa do gene B pelo produto de A (Fig. 1-b). Já uma linha com
uma seta estendendo-se de A para B indica uma regulação positiva do gene
B pelo produto de A (Fig. 1-c). Portanto, o circuito representa a regulação,
desencadeada por um sinal, do gene B pelo produto do gene A, o qual pode
agir como um repressor ou como um ativador.
Figura 1. Em (a), um circuito com um comutador simples, em que o regulador produto do
gene A age na expressão do gene B. Em (b), regulação negativa e em (c), regulação positiva.
Fonte: Biologia Molecular do Gene, 7ª ed., 2015.
A regulação do operon da lactose é um exemplo que integra os dois
tipos de circuitos, em que a transcrição é desencadeada por um indutor que
inativa o repressor Lac e pelo aumento da concentração de cAMP, que
promove a ligação do ativador CAP ao DNA. Portanto, a expressão do operon
Lac requer a ausência do repressor e a presença de CAP ligado a cAMP. Essa
regulação segue a lógica da “porta AND” (porta “e”), em que duas condições
de entrada são necessárias para um evento de saída (Fig. 2).
Figura 2. Porta AND na regulação do operon da lactose. Fonte: Biologia Molecular do Gene,
7ª ed., 2015.
AUTORREGULAÇÃO
A autorregulação negativa abafa o ruído e permite um rápido tempo de
resposta
De um modo geral, os genes reguladores controlam sua própria
expressão, bem como de outros genes. Essa autorregulação pode ser
negativa (Fig. 1-d) ou positiva (Fig. 1-e). Na autorregulação negativa, o gene
de um repressor é reprimido por seu próprio produto. No bacteriófago λ, por
exemplo, a ligação do repressor CI ao sítio operador OR3 bloqueia sua própria
transcrição.
Figura . Em (d), autorregulação negativa. Em (e), autorregulação positiva. Fonte: Biologia
Molecular do Gene, 7ª ed., 2015.
Dessa forma, a autorregulação negativa funciona como um
mecanismo de homeostase para garantir que a concentração da proteína
reguladora seja constante. No bacteriófago λ, se o nível de CI cair, a
expressão do gene cI e de outros genes-alvo volta a ser ativada até o
momento que a concentração de CI aumenta novamente e reprime o gene.
Se os níveis de CI forem muito altos, a autorregulação negativa garante que
o gene cI seja silenciado até que os níveis do repressor se diluam por
crescimento celular ou ação proteolítica.
A autorregulação negativa tem a vantagem ainda de permitir um
rápido tempo de resposta, em que um promotor relativamente forte garante
o rápido aumento no nível da proteína reguladora e a autoinibição da
transcrição cancela o excesso do regulador quando seu nível ótimo é
atingido (Fig. 3).
Figura 3. Cinética em resposta a um indutor, mostrando um comutador simples (B), um
autorregulador negativo (A) e um autorregulador positivo ©. Fonte Biologia Molecular do
Gene, 7ª ed., 2015.
A expressão gênica está sujeita a muito ruído
Quando se trata de ruído, na expressão gênica, é sobre o papel de
autorregulação negativa na homeostase. Hoje em dia ele é conhecido, como
níveis de expressão que podem variar substancialmente entre os indivíduos
de uma população, até mesmo entre duas cópias do mesmo gene na mesma
célula. Por isso define esse ruído , como uma variação na expressão gênica
sob condições que são aparentemente uniformes. Quando há a existência
de ruído indica que a estocastidade pode influenciar o nível de expressão de
genes individuais. A estocasticidade ela pode indicar um processo no qual é
caracterizado, até certo ponto, por aleatoriedade. Esse ruído, pode vir de
duas formas, sendo elas : intrínseca e extrínseca. As duas levam diferenças
na expressão gênica em uma população. Tratando se do ruído intrínseco, ele
se refere á variação no nível de expressão de genes individuais de uma
célula e deve se eventos estocáticos na maquinaria de expressão gênico. Já o
ruído extrínseco refere se as diferenças na expressão gênica entre células
em uma população aparentemente homogênea ou a alterações na expressão
gênica na mesma célula, ao longo do tempo. Este ruído é provavelmente
causado por micro hetegeneidade no ambiente da célula individual ou por
flutuações na capacidade de as células realizarem a transcrição ou a
síntese proteica ao longo do tempo. A auto regulação negativa , se vê que
este motivo regulador ajuda as células a lidarem com ruído ao permitir que
elas compensem variações no nível de expressão do gene autorregulado.
Quanto ao circuito regulador negativo, que controla a síntese de CI do
bacteriófago , é chamado de robusto. A estocasticidade não é peculiaridade
de E.coli. É provável que ela seja bastante difundida entre os organismo.
A autorregulação positiva retarda a expressão gênica
Quando se trata da autorregulação positiva ocorre quando uma
proteína ativadora estimula a transcrição do seu próprio gene. De novo, o
gene cI do bacteriófago fornece um exemplo clássico, mas é complexo, sob
baixas concentrações celulares, o repressor CI ocupa preferencialmente os
operadores OR2 ou OR1 que estão a , do promotor que dirige a transcrição
de Cl. A proteína CI ligada a O R2 contacta RNA- polimerase para estimular
a transcrição, promovendo mais síntese de CI. Por isso , o gene cI esta
sujeito para ambos tipo, tanto de autorregulação , positiva e negativa. O
acúmulo do produto gênico em estado de repouso ocorre quando a taxa de
síntese da proteína está em equilíbrio com a perda de proteína por
degradação ou pode ser também por diluição por meio de crescimento e
divisão da célula. O estado de repouso, ele se refere a uma condição na qual
o nível do produto gênico apresenta variação não significativo ao longo do
tempo. O ponto importante é que o tempo necessário para alcançar o estado
de repouso depois de um gene, é ativado é mais longo para caso da
autorregulação positiva do que para o caso da autorregulação negativa, oi
para ausência total de retroalimentação.
A autorregulação positiva, ela pode ser muito útil em processos
biológicos que se desenrolam lentamente, como o desenvolvimento que
podem beneficiar o acúmulo lento de proteínas envolvidas na morfogênese.
Quando é a autorregulação positiva tem um beneficio adicional, ela é a base
para um tipo de extremo de comutador conhecido como comutador
biestável.
Biestabilidade
Os circuitos reguladores abordados até o momento são reversíveis do
sentido de que, uma vez o sinal ativou um gene , ele é removido , o circuito
volta ao estado desativado. Há alguns casos, no entanto quando o gene é
ativado , ele permanece bloqueado, por períodos de tempo relativamente
longos.
Alguns circuitos reguladores persistem em estados alternativos
Um exemplo de comutador bem estável é o circuito que controla se a
B. subtilis irá ou não se tornar geneticamente competente, isto é, se ela
entrará no estado em que para de crescer e é capaz de captar DNA nu e
incorporar, por recombinação genética, sequências homólogas em seu
genoma. O regulador-mestre de competência é a proteína ComK, ativadora
de cerca de 100 genes, incluindo ele mesmo. O que o torna estável é a
cooperatividade entre as ligações da região promotora de comK com as
várias moléculas de ComK (Fig. 4).
Figura 5. Biestabilidade. A) a biestabilidade é regulada por um comutador autorregulador
positivo no qual a proteína ComK estimula a transcrição a partir do próprio gene comK,
bem como de genes-alvo. B) Exemplo de biestabilidade: células de B. subtilis tem expressão
para um gene-repórter sob controle de um promotor ativado pela ComK ativa (verde) ou
inativa (vermelho). Fonte: Biologia Molecular do Gene, 7ª ed., 2015.
O potencial celular para ativar comK é controlado por uma via reguladora
que atua em estabilidade proteolítica de ComK, ainda assim, no entendo, a
ativação do comK é estocástica. Isto significa que, quando em condições nas
quais ComK não corre risco de degradação, apenas algumas células se
tornam competentes. A bifurcação em subpopulações ativa e inativa na
figura x ocorre porque o circuito de retroalimentação positiva está no limiar
entre ter ComK insuficiente para ativação do comK e ter ComK suficiente
apenas para a ativar os genes controlados pelo seu circuito autorregulador
positivo. Assim, as variações nos níveis de ComK entre as células,
resultantes desta expressão ruidosa do comK, permitem que o ativador
alcance a concentração-limiar somente em algumas células.
Quadro 22 - 1 Biestabilidade e histerese
Este experimento sobre a autorregulação positiva do comK é baseado no
uso de uma cópia modificada do gene posta sob o controle de um promotor
modulado para cima ou para baixo em resposta a um indutor. (Fig.1-A).
Células com apenas o gene mutante não apresentam biestabilidade,
sendo que o aumento do nível de expressão gênica dirigida por ComK em
resposta aos níveis crescentes de indutor sugere distribuição unimodal dos
níveis de expressão na subpopulação em qualquer concentração de indutor
(Fig.1-B). Entretanto, em células com ambos genes original e mutante,
concentrações crescentes de indutor fazem as células bifurcarem em uma
subpopulação com baixa atividade de ComK e outra subpopulação com alta
atividade de ComK (Fig.1-C).
Em sentido estrito, o uso do termo “biestabilidade” exige um comutador
que apresente histerese, ou seja, um tipo de memória que permita a não
desativação imediata do comutador quando suas condições originais (que o
ativaram) são revertidas.
Comutadores bimodais variam em sua persistência
Comutadores biestáveis são bimodais porque podem permanecer em
estados estáveis alternativos por longos períodos de tempo, sendo que
alguns desses circuitos com bimodalidade são ditos como "excitáveis" por
não persistirem nos estados estáveis alternativos. Tais sistemas excitáveis,
assim como os biestáveis, envolvem um circuito autorreforçador que gera
respostas estereotipadas a uma pequena perturbação. No entanto, a
mudança para um estado alternativo é efêmero e facilmente reversível.
Um circuito excitável é o potencial de ação de um neurônio, por
exemplo. Neurônios possuem um potencial de repouso de geralmente
-70mV, no qual a concentração de cátions fora da célula é levemente maior
que dentro dela. Se o potencial aumentar acima de um limiar (-55mV, a
pequena perturbação) os canais iônicos que dependem de voltagem se
abrirão, permitindo que íons de sódio adentrem a célula e assim gerando
um pico de voltagem positiva (+40mV) dentro da célula (resposta
estereotipada). Esta alta voltagem promove o fechamento dos canais iônicos,
os íons de sódio em excesso são expelidos para fora do neurônio e assim a
membrana retorna ao seu estado original de repouso (reversão rápida da
resposta à perturbação).
Da mesma forma, podem ser considerados excitáveis os circuitos
autorreforçadores que não conseguem manter estados estáveis por longos
períodos ou que desencadeiam eventos subsequentes que causam sua
reversão. Assim, o sistema de competência genética abordado anteriormente
também pode ser considerado excitável. A autorregulação positiva por ComK
gera um comutador biestável capaz de manter altos níveis de ComK por
longos períodos de tempo. No entanto, sobreposto à síntese autorreforçadora
de ComK está um circuito de retroalimentação negativo que leva a proteína
ativadora à destruição. Isso permite que as células competentes saiam deste
estado e retornem ao estado vegetativo proliferativo.
Mas como as células de B. subtilis mudam de um estado para o outro?
Devido às proteínas SinR e SInR de um circuito duplo-negativo, no qual
SinR reprime o gene da SInR e esta inibe SinR, prendendo-a em um
complexo (SInR-SinR) no qual não consegue mais reprimir seu gene. Assim,
um braço do complexo atua em nível de interação proteína-proteína e outro
em nível de transcrição gênica.
O comutador existe em dois estados autorreforçadores: o estado (I)
SInR
baixo
, no qual seu gene está sendo reprimido por SinR, e o estado (II)
SLnR
alto
, no qual esta inativa a proteína SinR e desinibe seu gene. Células no
estado (I) expressão genes por motilidade e separação celular, portanto, são
formas livres em suspensão. Células no estado (II) são reprimidas para
genes de motilidade e separação celular, portanto, crescem como cadeias
sésseis.
Figura 6. Circuito excitável que controla a troca entre estados celulares alternativos. A)
Representação do circuito duplo-negativo que controla motilidade e formação de cadeias
(SIr=SInR e R=SinR). B) Canal microfluídico fechado na base e aberto no topo, à medida que
as células crescem e se dividem elas saem pelo topo. O quimógrafo mostra uma série de
micrografias de time-lapse tiradas em intervalos de 5 minutos. Uma célula móvel (em verde)
na base esquerda troca para um estado de formação de cadeia (em vermelho), gerando
progênie que mantém tal estado. Uma célula que forma cadeias (em vermelho) na base
direita, retorna ao seu estado móvel (em verde) e gera progênie que mantém seu estado de
motilidade.
Circuitos de feed-foward
Considerado uma grande contribuição no ramo de biologia de
sistemas. É um achado entre os circuitos reguladores que são
consideravelmente simples. São redes com três nós que possuem
propriedades benéficas e são utilizados no desenvolvimento.
Circuitos de feed-foward são redes com três nós que possuem
propriedades benéficas
Um bom exemplo são redes que consistem em três nós (Fig. 22-7a).
São conhecidas 13 maneiras de conectar três nós com bordas, podendo ser
diferenciadas pela direção delas, se as bordas conectam dois ou três nós ou
se pares de nós são ligados por uma ou duas bordas, um dos 13 padrões
são conhecidos como circuito de feed-forward (Fig. 22-7b). É referido como
“motivo de rede” porque é um assunto recorrente em circuitos genéticos. O
motivo de rede consiste em um fator de transcrição A que controla o gene
para um segundo fator de transcrição B (Fig.22-7b). Que controlam o
terceiro gene no motivo C.
Quando os sinais são atribuídos às bordas direcionais, oito tipos de
circuitos de feed-forwardpodem ser distinguidos. Porém, a seleção natural
favoreceu dois que são encontrados mais frequentemente do que os outros.
Um dos motivos são conhecidos como motivo coerente e o outro motivo
incoerente, no motivo coerente, as vias direta e indireta levam ao gene-alvo e
representam a saída possuindo o mesmo sinal e no motivo incoerente, as
duas vias possuem sinais diferentes, com o gene-alvo C sujeito ao controle
positivo por A na via direta e controle negativo por B na via indireta. Nos
dois casos, a expressão do gene-alvo está sujeita à lógica de uma porta AND,
isto é, a transcrição de C requer A “AND” B (A e B) na primeira e A “AND
NOT” B (A, mnas não B), na última. O circuito de feed-forward coerente
possui as propriedades de requerer uma entrada sustentada para que o
gene-alvo C seja transcrito (Fig.22-7c). O motivo de feed-forward incoerente
tem sua própria característica benéfica (Fig 22-7d), porque é um gerador de
pulso que provoca a ligação da expressão gênica e seu desligamento; e o
ativador A liga o gene-alvo C, porém com o tempo o acúmulo do repressor B
vai causando o desligamento do gene-alvo. Assim, o circuito de feed-forward
incoerente é útil quando a expressão gênica é necessária apenas por um
pequeno período de tempo.
Fonte: Biologia Molecular do Gene, 7º ed., 2015.
Circuitos de feed-foward são utilizados no desenvolvimento
Eles vão revelar princípios de design em vias complexas. Em certos
casos, combinações de circuitos coerente e incoerentes é usada para
produzir padrões elaborados de atividade gênica.
Os circuitos que são coerentes garantem que a entrada para o circuito
seja persistente e, portanto, que o desenvolvimento não seja desencadeado
no momento e nem no local errado. Já os circuitos incoerentes são usados
para gerar pulsos sucessivos de expressão gênica ao longo do curso da
morfogênese. Um exemplo seria que um alvo direto da Dorsal é o gene twist.
Este motivo regulador é, de fato um exemplo de um circuito feed forward
coerente.
Circuitos oscilantes
Outro tipo de controle gênico de grande importância na biologia é a
oscilação na qual a expressão de grandes números de genes é
periodicamente ativada, e então desativada. A elucidação do circuito que
controla este comportamento oscilatório, e fazê-lo de maneira quantitativa, é
um dos principais desafios da biologia de sistemas.
Figura 8. Os circuitos que controlam a formação de esporos são uma série de Feed-Forward
conectados. Fonte: Biologia Molecular do Gene, 7º ed., 2015.
Alguns circuitos geram padrões oscilantes de expressão gênica
No ciclo celular da bactéria Caulobacter crescentus há um circuito
regulador oscilante (Fig. 9). Nesse caso, os reguladores-mestres CtrA e GcrA
estão presentes de forma alternada dirigindo a expressão gênica em um
padrão oscilatório ao longo do curso do ciclo celular. Outro exemplo de
comportamento oscilatório é o ciclo circadiano em moscas e mamíferos. Esse
circuito é uma retroalimentação negativa que envolve as proteínas
ativadoras Clock e Cycle e o autorepressor Per (Period). Essas proteínas se
ligam à região reguladora de Per, estimulando sua transcrição até que as
proteínas Per se acumule em níveis críticos. Nesse momento, a proteína Per
consegue se contrapor a ação de Clock e Cycle e desligar a sua própria
síntese.
Com essa desativação a proteína Per é depletada da célula, levando a
um nível sublimiar do autorrepressor, que é insuficiente para bloquear a
ativação por Clock e Cycle. Esse ciclo de ativação/desativação ajuda a
definir o ciclo de 24 horas da atividade gênica. O ciclo circadiano é
dependente do tempo de síntese e degradação da proteína Per, mudanças de
estabilidade nessa proteína pode desencadear frequências oscilantes a cada
22 ou 26 horas.
A autorregulação negativa parece estar envolvida na expressão gênica
oscilatória na formação dos somitos em embriões de vertebrados (Fig. 10a).
Os somitos se formam da cabeça à cauda (pelo menos no zebrafish) e
dependem da atividade oscilatória LIGADA/DESLIGADA dos genes
reguladores her1 e her7. A expressão cíclica desses genes ocorre até que as
células do somito estejam prontas para se diferenciar. O amadurecimento de
cada novo lote de célula leva a interrupção da oscilação, algumas células
ficam paradas no máximo de seu ciclo oscilatório e outros no mínimo. Essa
expressão gênica foi submetida à modelagem matemática e a simulações de
computador.
Os níveis oscilantes dos produtos dos genes repressores regulam a
expressão de outros genes para definir o padrão de cada novo somito. No
zebrafish a cada 30 minutos um novo somito é formado, esse tempo decorre
do atraso entre o período em que os genes her1 e her7 estão ligados e o
acúmulo dos autorrepreçores até desligar a sua própria síntese (Fig. 10b). A
sincronização da expressão gênica oscilatória em células vizinhas de um
futuro somito ocorre por uma via intersinalização célula a célula. Os genes
reguladores, her1 e her7, codificam a proteína de superfície celular Delta
que irá que se liga à proteína receptora Notch em células vizinhas. Esse
mecanismo ocasiona ciclos sobrepostos de autorregulação negativa e
sinalização intercelular durante a oscilação das células que originam os
somitos.
Figura 9. Os reguladores CtrA e GcrA aumentam e diminuem em abundância fora de fase
um com o outro durante o ciclo celular de Caulobacter. Fonte: Biologia Molecular do Gene,
7º ed., 2015.
Figura 10. Expressão de genes de somitos no desenvolvimento dos vertebrados. Fonte:
Biologia Molecular do Gene, 7º ed., 2015.
Circuitos sintéticos mimetizam algumas das características das redes
reguladoras naturais
No campo da biologia sintética, os princípios do design que controlam
as redes reguladoras podem ser entendidos pela construção de circuitos que
mimetizam os sistemas naturais, o que é o caso do “repressilador” em E.coli.
O repressilador é uma rede de três nós, em que três protéinas reguladoras
estão ligadas umas às outras de maneira circular e com bordas negativas.
Esse sistema consiste em genes para os repressores bacterianos λCI, LacI e
TetR. Apesar de ser um circuito de três nós, o repressilador tem um padrão
oscilatório de transcrição de impressionante 2 horas. Provavelmente,
flutuações nos níveis dos três repressores ocasionada por ruídos impedem
que o sistema alcance o estado de repouso, resultando em padrão oscilatório
de expressão.
O sistema do repressilador é muito menos robusto do que o
comportamento dos sistemas naturais, mostrando que sistemas sintéticos
são inadequados para mimetizar os circuitos mais complexos de osciladores
naturais. Outras redes criadas sinteticamente são armazenadas em uma
biblioteca de circuitos artificiais criada a partir de variedades de
combinações de múltiplos fatores de transcrição e promotores. Em placas de
ágar também são criadas linhagens “remetentes” (no centro da placa,
produzem moléculas sinalizadoras) e “respondentes” (em toda a placa,
respondem de maneiras diferentes de acordo com as concentrações
recebidas de moléculas sinalizadoras). Os respondentes produzem
proteínas- repórter cromogênicas distinguíveis, produzindo cor em padrão
de halo de acordo com a distância das células remetentes.