Atividade metodos alternativos

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DISCIPLINA: CONTROLE BIOLÓGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS
PROFESSORA: NATHÁLIA CARTAXO
ALUNO(A): 
AVALIAÇÃO CONTÍNUA SOBRE MÉTODOS ALTERNATIVOS
1. O que são métodos alternativos para enumeração de microrganismos?
Vão ser novas alternativas e paradigmas em relação a identificação de microrganismos nos produtos farmacêuticos, uma nova forma de controle de qualidade, sendo métodos que agilizam esse processo de controle de qualidade nos produtos farmacêuticos.
2. Qual é a importância de validar métodos alternativos? Cite os parâmetros que devem ser aplicados, baseado no PDA e resolução 899.
É importante validar, pois há uma grande variabilidade em relação aos resultados, e os produtos testes devem estar em conformidade com o produto farmacêutico de acordo com a USP 24. Onde pode-se variar fatores como: distribuição da amostra, morfologia celular do microrganismo, atividade metabólica, de acordo com o tipo de espécie. 
Assim os métodos devem ser avaliados, considerando as fontes de variação, salientando aspectos particulares dos métodos rápidos de validação microbiológicas. Os parâmetros que devem ser aplicados são: Adequação ao uso; Reprodutibilidade; Complexidade dos Métodos rápidos; Equipment Qualification Model(EQM); É necessário que se faça: método de exatidão, precisão, especificidade qualitativa e quantitativa, limites de quantificação e detecção, linearidade, faixa, robustez e equivalência.
3. Quais as desvantagens dos métodos clássicos?
Consumo de tempo e eficiência O do processo de fabricação. Se baseiam no método do cultivo – baixa velocidade do crescimento microbiano; Os vários dias de incubação perda de produtos contaminados; Podem não ser capazes de recuperar todos os microrganismos e Potencial liberação de produto contaminado – respostas heterogêneas.
4. Quais são as principais tecnologias aplicáveis para a enumeração de microrganismos como métodos alternativos?
Eletroquímicos, Bioluminescência, Epifluorescência e Citometria.
5. Explique o princípio da técnica de citometria, fluxo e fase sólida.
Mede as propriedades de dispersão da luz pelas células e emissão de luz de anticorpos monoclonais que estão associados a fluorocromos ligados a superfície da célula, faz a contagem e a diferenciação de célula e apresenta diversidade de aplicação, como análise de medicamentos, análise de água.
Citometria de fluxo:
 
Permite diferenciar os microrganismos viáveis de partículas não viáveis. Menos sensível que a citometria de fase sólida, mas a citometria de fluxo => análise de materiais filtráveis e não filtráveis, (~90 minutos). A sensibilidade pode ser melhorada ao se adicionar uma etapa de
incubação em meio de cultura.
Mais sensível, pois é capaz de identificar uma única célula por filtro.
Citometria de fase sólida: 
	Baseia-se em princípios da Epifluorescência utilizando 4 etapas.
1 – Membrana filtrante: Utilizada para reter os microrganismos contaminantes
2- Identificação: É feita com um fluoróforo. Antes ou após a filtração.Inicialmente, é um
substrato conjugado não fluorogênico – requer atividade para exercer fluorescência. 
3- Excitação: Por laser e varredura automatizada. Permitem a detecção de microrganismos viáveis.
4- Software: Permite a diferenciação de microrganismos viáveis e partículas autofluorescentes.
Em resumo: Baseia-se na reação intracelular de corantes vitais com enzimas de microrganismos viáveis, que retém o fluoróforo. 
6. Por que os laboratórios/indústria gostam de utilizar o MALDI-TOF?
Por ser mais rápida e especifica, capaz de determinar até a espécie bacteriana, onde: 
A análise completa da célula bacteriana fornece um único espectro de massa intrínseco ao microrganismo a partir de macromoléculas. A característica de não necessitar a preparação da amostra, analise rápida e alto comprometimento tecnológico torna este um método que chama atenção para a identificação rápida, podendo ser aplicável a bactérias e fungos.
7. Quais as tecnologias aplicadas para verificar o crescimento, a viabilidade, componentes celulares e ácidos nucléicos (explique do jeito que está na conclusão dos slides).
Tecnologias baseadas nos ácidos nucleicos
Técnicas de sequenciamento do RNAr, porções 16S e 23S; 
Impressões digitais (fingerprint) – PCR baseadas na sequência repetitiva 
Amplificação da transcrição – mediada em tempo real;
Crescimento
Bioluminescência do ATP : parâmetros bioquímicos ou fisiológicos refletem o crescimento dos microorganismos 
Viabilidade
CITOMETRIA DE FLUXO POR COLORAÇÃO VITAL OU FLUORESCÊNCIA, MICROSCOPIA DIRETA DE FILTRO EPIFLUORESCENTE: Coloração vital de componentes bioquímicos das células microbianas, Fluorescência da clivagem enzimática de substratos fluorogênicos das paredes celulares
Tecnologias baseadas em componentes celulares ou artefatos
Medida de componentes celulares
MALDI-TOF, aglutinação de látex, coloração de gram.
8. Escolha uma tecnologia e explique sobre a mesma, com exceção da citometria. 
Métodos eletroquímicos: Baseiam-se na mudança de impedância quando os eletrodos são inseridos nos frascos de cultura, se estiver contaminado haverá um metabolismo iônico, altamente carregado, decorrente da interação dos meios com os microorganismos presentes, através de nutrientes presentes nos meios que são fracamente carregados, ocorrendo a modificação nas propriedades elétricas. Esse teste pode ser aplicado para ensaios microbiológicos de antibióticos e também para a contagem de viáveis totais, o sistema deve ser bem controlado para que se possa observar a interação dos ions e consequentemente gerar uma curva de crescimento microbiano.