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Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Curso de Biomedicina AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO PH E AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA Discente: Renata Marques De Souza Kran Goiânia 2017 Renata Marques De Souza Kran AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DO PH E AÇÃO ENZIMÁTICA: EFEITO DA TEMPERATURA Relatório requerido pela disciplina de Bioquímica Ministrada pelo Professora: Rosália Santos Amorim Jesuino Goiânia 2017 1 Sumário 1 Introdução……………………........………………………………..04 2 Materiais e Métodos.........……………………….........................05 3 Resultados e Discussões…………………………………….......07 4 Conclusão........…………............................................................08 5 Referências bibliográficas…...……….......................................08 1 Introdução A cinética enzímática é um ramo da Bioquímica que estuda as enzimas em ação; a sua atividade catalítica. No entanto, pode também ser encarada como um ramo da cinética química que estuda as propriedades catalíticas das enzimas. O estudo cinético de uma enzima visa primariamente caracterizar, ou seja descrever, a atividade dessa enzima. In vitro estuda-se a atividade da enzima procurando saber que tipo de reações pode catalisar, com que substratos pode interatuar e como se modifica essa atividade (qualitativa e/ou quantitativamente) quando se fazem variar as condições em que é ensaiada. O valor de pH, a temperatura, o tempo de incubação, as concentrações dos substratos, de cofactores ou de outras substâncias (inibidores ou ativadores) são exemplos de condições de ensaio que podem ser modificadas com o objetivo de observar como varia a atividade da enzima, ou seja, como varia a velocidade da conversão ou conversões que esta catalisa. Em 1902,Henri e Brown admitiram a formação do complexo enzima-substrato (ES). Em 1913, Michaelis e Menten conceituaram a formação desse complexo, em termos de derivação matemática, em uma equação de velocidade que foi, posteriormente, generalizada por Briggs e Haldane com a equação: Então, os cientistas chegaram a seguinte expressão: A constante de Michaelis-Menten (Km) corresponde à concentração de substrato com a qual a velocidade da reação enzimática atinge a metade da velocidade máxima. As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reação (v) aumenta com o acréscimo de [S]. Todavia, à medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax. 2 Materiais e Métodos Materiais · Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). · Tampão citrato-fosfato 0,05 M pH 2,0 · Tampão acetato 0,05 M; pH 4,0 · Tampão acetato 0,05 M; pH 5,0 · Tampão fosfato 0,05 M pH 6,0 · Tampão fosfato 0,05 M pH 7,0 · Tampão fosfato 0,05 M pH 8,0 · Tampão bicarbonato 0,05 M pH 9,0 · Sacarose 0,2 M · Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) · Pipetas graduadas de 1 e 10mL · Tubos de ensaio · Banho Maria · Espectrofotômetro Métodos Segui se os protocolos abaixo: Reativos Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampão citrato-fosfato 0,05M pH 2,0 1,0 1,0 -- -- -- -- -- -- Tampão acetato 0,05M; pH 4,0 -- -- 1,0 -- -- -- -- -- Tampão acetato 0,05M; pH 5,0 -- -- -- 1,0 -- -- -- -- Tampão fosfato 0,05M pH 6,0 -- -- -- -- 1,0 -- -- -- Tampão fosfato 0,05M pH 7,0 -- -- -- -- -- 1,0 -- -- Tampão fosfato 0,05M pH 8,0 -- -- -- -- -- -- 1,0 -- Tampão bicarbonato 0,05M pH 9,0 -- -- -- -- -- -- -- 1,0 Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Aquecer a 100°C durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 Resfriar os tubos em bacia contendo gelo. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540nm. Para ação de enzima e efeito de temperatura seguiu se: Reativos Tubos 1 2 3 4 5 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,2 0,2 0,2 0,2 Pré-incubar os tubos nos seguintes banhos durante 5 minutos --- 25°C 37°C 55°C 100°C ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Aquecer a 100°C durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 RESULTADOS (Absorbância) 3 Resultados e Discussões Influência do pH Em 3 tubos foram adicionados 1,5 mL das soluções de sacarose a 0,2 mol/L em diferentes pHs: 3,6; 5,0 e 8,0. Os 3 tubos e o tubo contendo a enzima foram postos em banho à 37º C por 5 minutos. Adicionouse 0,5 mL de enzima a cada um dos 3 tubos. Depois os tubos foram incubados a 37º C por 15 minutos e se adicionou 1 ml de DNS, em cada tubo. Retirou-se os tubos do banho e estes foram levados ao banho de água fervente por 5 minutos, e depois os tubos foram resfriados em água corrente. Nos tubos foram adicionados 6,5 mL de água destilada e foram homogeneizados. Em seguida se observou a coloração dos tubos. 3. Influência da Temperatura Adicionou-se em 3 tubos 1,5 mL da solução de sacarose a 25 mmol/L em tampão acetato (pH 5,0). Os 3 tubos com a solução de sacarose e o tubo contendo a enzima foram postos em suas respectivas temperaturas (4, 37 e 100° C) por 5 minutos. Em seguida se adicionou 0,5 mL de enzima a cada um dos 3 tubos. Os tubos foram incubados, a diferentes temperaturas, por 15 minutos para que a hidrólise acontecesse: banho de gelo (4º C), banho à 37º C e banho fervente (100º C). 1 mL de DNS foi adicionado em cada tubo. Retirou-se os tubos imediatamente do banho e estes foram levados ao banho de água fervente por 5 minutos, que depois foram resfriados em água corrente. Por fim, 6,5 mL de água destilada foi adicionado e se observou a coloração dos tubos. Figura abaixo: Na imagem acima, é possível observar os resultados dos testes da velocidade catalítica da enzima invertase em solução tampão de pH 3,6 , 5,0 e 8,0 respectivamente. Foi possível observar que a enzima teve uma melhor atuação em pH 8,0. Esse resultado não era o esperado para o estudo da enzima em questão, que deveria apresentar uma melhor atuação em pH 5,0. No entanto, pode-se considerar que o tipo de fermento utilizado para a sua extração tenha sido o causador dessa alteração. A influencia de pH ocorre porque as enzimas são uma espécie de proteínas, que por sua vez, apresentam cadeias polipeptídicas compostas por aminoácidos. A estrutura tridimensional das enzimas, portanto, depende das interações entre os aminoácidos com grupamentos laterais ionizáveis presente na cadeia, cujo o estado de ionização depende do pH do meio. Valores inadequados do pH podem provocar mudanças conformacionais irreversíveis e consequentemente causar a perda da atividade catalítica. Dependendo do valor do pH a geometria do sítio ativo pode ser mais ou menos adequado para o processo catalítico, resultado em variações na velocidade da reação. Muitas enzimas interagem com seus substratos através dos grupos ionizáveis de seus sítios ativos e das moléculas do substrato. Logo, a formação de complexo produtivos dependem da ionização tanto do sítio catalítico quanto do substrato. Pode-se dizer que os valores de pH influenciam na velocidade da reação por pelo menos três fatores: conformação do sítio ativado, ionização do sítio ativado e ionização do substrato. 4 Conclusão Conclui-se que a concentração do substrato, a temperatura e o pH influenciam na velocidade da reação. Tanto quantitativamente como qualitativamente. Portanto, para que certa reação seja catalisada de forma produtiva pela enzima, a solução deve-se encontrarem condições ideias, quem inclui: ajuste do pH e da temperatura. Mesmo que por algum erro de procedimento a influência do pH tenha tido um erro e o pH ótimo foi o pH 5,0. 5 Referências bibliográficas Cisternas, J. R. et al ; Varga, J. ; Monte, O. Fundamentos de Bioquímica Experimental - 2 ed. - São Paulo: Editora Atheneu, 2001. págs 149 e 151.
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