Produção de embriões in vitro

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Biotecnologia e Reprodução Animal – Medicina Veterinária – Jennifer Reis da Silva – É PROIBIDA A COMERCIALIZAÇÃO DESTE CONTEÚDO 
 
Introdução 
A Produção in vitro, também conhecida pela 
sigla PIV é uma biotecnologia mais 
complexa, quando comparada com a 
Transferência de Embriões (TE). Isso porque 
na TE todo o processo ocorre do organismo 
de um animal vivo (in vivo) enquanto na PIV 
o processo é feito em laboratório, ou seja, 
fora do ambiente tubário, logo há maiores 
riscos também. 
 
Podemos nos perguntar então o porquê de 
realizar a PIV já que temos a TE que acaba 
sendo uma técnica mais barata e com menos 
riscos. Devemos entender então que toda 
biotecnologia é uma ferramenta de trabalho 
e cada ferramenta tem seu propósito e é 
utilizada em determinada situação já que o 
ideal da assistência reprodutiva é conseguir, 
dentro de uma mesma fazenda, aplicar 
vários tipos de biotecnologias dependendo 
das fêmeas a serem trabalhadas. 
 
Quando comparamos as biotecnologias já 
vistas podemos ver que a inseminação 
artificial é a mais simples e é a base de tudo, 
podendo ser realizada não somente por 
médicos veterinários, mas também por 
funcionários que receberam o devido 
treinamento. 
 
A Transferência de Embriões não é tão 
simples, logo, sem uma estrutura necessária 
não é possível realizar essa biotecnologia que 
deve ser somente realizada por um médico 
veterinário, porém ainda é possível fazer 
tudo a campo. 
Já a produção in vitro, transgenia e 
clonagem são biotecnologias ultra 
especializadas havendo a necessidade de um 
laboratório com equipamentos específicos 
para serem realizadas. 
 
Quanto a disseminação da genética de um 
animal podemos concluir que a inseminação 
artificial é importante na disseminação da 
genética dos machos já que o volume 
ejaculado numa única coleta pode ser 
distribuído para várias fêmeas, dependendo 
da qualidade do sêmen e espécie, podendo 
ser utilizado para fertilizar até 100 fêmeas 
ou mais quando tratamos dos bovinos. 
 
Quanto ao repasse da genética das fêmeas 
com maior intensidade, as biotecnologias 
recomendadas são as que envolvem embrião 
como a TE e a PIV, já que é possível produzir 
um numero de embriões maior do que seria 
possível naturalmente. 
Na TE, por mais que consigamos otimizar a 
eficiência reprodutiva da fêmea, há um 
 
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limite como o uso de hormônios, logo não é 
possível realizar sempre essa técnica além da 
baixa quantidade de embriões produzidos 
em cada superovulação. 
A PIV, por sua vez, permite a fêmea 
produzir mais embriões quando comparada 
a TE. Apesar do maior custo e maior 
complexidade, a médio prazo acaba se 
pagando já que é mais eficiente por produzir 
mais embriões reduzindo o custo individual 
de cada embrião. 
Histórico da Produção in vitro de 
embriões 
A Produção de embriões in vitro é uma 
técnica considerada nova, porém já existe há 
mais tempo do que imaginamos. Os estudos 
foram iniciados no século XIX utilizando 
estrelas do mar e em 1955 houveram os 
primeiros estudos de Maturação in vitro 
(MIV) em coelhos. O primeiro bebê humano 
nasceu em 1978 na Inglaterra e foi 
chamado de Louis Brown. Com isso 
podemos concluir que a medicina veterinária 
acaba estando mais avançada quanto a 
medicina humana quando falamos da 
Produção in vitro já que os estudos em 
animais são mais antigos do que em 
humanos. 
O primeiro bezerro fertilizado in vitro (FIV) 
foi produzido em 1982 nos EUA. Embora 
seja uma técnica que nos permite criar um 
ser em laboratório, ainda há uma constante 
evolução, uma vez que ainda há muitos 
riscos. 
No gráfico acima podemos ver o crescimento da 
produção in vivo (cinza) comparado com a 
produção in vitro (verde) desde 1997 até 2016 
no mundo. Podemos observar que houve um 
crescimento acentuado da PIV que acabou 
ultrapassando a produção in vivo e atualmente 
os valores seguem os do gráfico. 
 
No gráfico acima podemos ver os dados obtidos 
no Brasil que é o país que mais produz embriões 
in vitro no mundo. É possível notar que a PIV 
aumentou conforme os anos, chegando quase a 
400 mil embriões em 2011 enquanto a TE 
acabou tendo queda nos valores. 
 
Hoje em dia, na espécie bovina há maior 
produção de embriões in vitro quando 
comparado com in vivo por ser uma 
biotecnologia mais eficiente levando em 
consideração o número de embriões obtidos 
por ciclo já que, in vitro, é possível coletar 
um alto número de ovócitos com maior 
frequência. 
 
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Aplicações da Produção in vitro 
 Propósito comercial com o propósito de 
difundir a genética; 
 Empregada em situações especiais como 
infertilidade; (importante que os 
ovários devem estar íntegros para que 
possa ser feita a coleta de oócitos); 
 É um pré requisito para biotecnologias 
mais avançadas como transgenia e 
clonagem. 
 Auxilia na elucidação dos mecanismos 
moleculares do desenvolvimento 
folicular, logo pode ser utilizado em 
pesquisas. 
Limitações da Produção in vitro 
 Inconsistência de resultados já que a 
taxa de gestação é baixa, ou seja, em 
média 40% dos animais se torna um 
embrião desenvolvido e pronto para ser 
transferido em razão das taxas de 
recuperação de mórulas e blastocistos; 
 Taxa de gestação é 20 a 60%; 
 As perdas são limitantes por conta do 
alto custo e também do custo inicial de 
implementação da infraestrutura; 
 Tempo consumido para executar todo o 
processo; 
 Inexistência de protocolos de 
criopreservação adequados sendo a 
vitrificação um processo se mostrando 
promissor. 
 
Etapas da Produção in vitro 
• Colheita de oócitos; 
• Maturação in vitro (MIV) 
• Fecundação in vitro (FIV); 
• Cultivo ou co-cultivo embrionário. 
Seleção de receptoras 
As receptoras devem ser selecionadas com 
base em seu escore de condição corporal e 
atividade cíclica regular. Além disso, é 
necessário que o tamanho do animal que irá 
receber o embrião seja condizente com o 
tamanho da raça do embrião a ser 
transferido para que o parto ocorra 
adequadamente e, por fim, que tenha boa 
habilidade materna já que irá cuidar do 
filhote nos primeiros meses de vida. 
 As receptoras normalmente são 
mestiças tendo genética tanto taurina 
quanto zebuína preservando a 
rusticidade. 
Seleção de doadoras 
As doadoras precisam ter um bom potencial 
genético avaliado por meio de testes além de 
alta performance reprodutiva. 
O ideal é que tenha um bom estado 
nutricional e reprodutivo, sendo aceitos 
problemas extraovarianos (útero, tuba, 
cérvix), fêmeas com idade avançada; fêmeas 
de exposição; gestantes (1/3 inicial); fêmeas 
no pós parto imediato (anestro) e pré 
púberes (acima de 6 meses). 
 
 
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As doadoras não recebem tratamento 
hormonal e por isso a frequência de coleta 
pode ser maior (a cada 3 semanas, em 
média). A fêmea pode estar em qualquer 
fase do ciclo estral já que a coleta depende 
da evolução folicular. 
 
Coleta de Ovócitos 
Para fazermos uma coleta de ovócitos é 
necessário contermos o animal no tronco, 
realizar a limpeza retal e aplicar uma 
anestesia epidural que é muito importante 
já que a fêmea pode estar com a cérvix mais 
fechada. 
 
A coleta não precisa ser somente dessa 
forma podendo ser realizada após castração, 
em ovários recuperados de abatedouro, via 
cirúrgica em laparoscopia quando tratamos 
de espécies menores, etc. 
 
 
 
 
Técnica de OPU 
 
Em bovinos, a coleta dos oócitos é realizada 
pela técnica de OPU (Ovum pick up – 
punção ovariana) com o auxílio de um 
ultrassom.Uma das mãos é introduzida no reto para 
encontrar e segurar o ovário. A outra mão, 
segurando uma probe de ultrassom, deve ser 
introduzida pela vagina. A probe imite feixes 
de ultrassom em sua ponta, logo é possível 
enxergar tudo o que está a sua frente. É 
necessário que a probe seja introduzida até 
o fundo da vagina e, com a mão que está 
segurando o ovário, devemos aproximar o 
ovário da probe para que então possamos 
enxerga-lo e inspecioná-lo. Pelo meio da 
probe é possível passar uma agulha retrátil 
que perfura o fundo da vagina e entra no 
ovário sendo possível acompanhar pelo 
monitor do us. A agulha é conectada a um 
aparelho que faz um vácuo leve funcionando 
como uma seringa permitindo a sucção, logo 
é possível aspirar o líquido presente dentro 
dos folículos ovarianos e armazená-lo em 
um recipiente em banho maria. O 
 
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procedimento é realizado nos dois ovários e 
então é retirado os materiais. 
O folículo selecionado para aspiração deve 
conter de 2mm a 8 mm que provavelmente 
estarão no pré pico de LH e, 
consequentemente, terão mais chances de 
desenvolvimento até o blastocisto. Folículos 
menores de 2mm não conseguirão reiniciar 
a meiose e folículos maiores de 8mm já 
estarão em maturação ou atresia, logo, os 
folículos a serem selecionados devem estar 
em crescimento. 
 
Ao aspirar o conteúdo folicular, o que sobra 
acaba sofrendo atresia. 
O conteúdo aspirado é composto pelo oócito 
e corona radiata composta por células da 
granulosa que irão auxiliar no seu 
desenvolvimento. 
 
 
 
Quanto mais tempo demora o processo, pior 
a qualidade dos oócitos, logo, é necessário 
que sejamos rápidos e precisos. 
Após a coleta, os oócitos são remanejados 
para uma placa de petri 
 
Avaliamos os oócitos observando a 
integridade da corona radiata e fazemos 
uma pré seleção devendo ser descartados 
oócitos com corona radiata desintegradas e 
oócitos degenerados. 
 
 
Acima observamos oócitos cercados pelas coronas 
radiatas. Podemos ver que algumas coronas 
radiatas se encontram uniformes enquanto 
outras estão aparentemente se desintegrando. 
Na imagem D um oócito está sendo apontado 
pela seta vermelha. Esse oócito está degenerado 
já que nem conseguimos vê-lo. 
 
Maturação in vitro 
Pegamos uma placa de Petri e colocamos 
um meio específico para maturação e 
colocamos na placa em gotas. Os oócitos 
selecionados são inseridos em cada gota e 
então a placa é levada para uma estufa com 
baixa concentração de CO2 e alta umidade, 
com 39º de temperatura. As placas são 
 
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deixadas em torno de 1 dia para simular o 
ambiente intrafolicular. 
Após 24 horas levamos a placa para um 
microscópio para avaliarmos os oócitos. 
 
Avaliando a maturação dos ovócitos 
 
 
Sabemos que a maturação deu certo 
avaliando dois quesitos: EXPANSÃO DAS CÉLULAS 
DA CORONA RADIATA e PRESENÇA DO PRIMEIRO 
CORPÚSCULO POLAR. Quando a corona radiata 
teve uma expansão uniforme consideramos 
uma boa maturação e, quando vemos o 
primeiro corpúsculo polar vemos que houve 
um desenvolvimento já que a célula se 
dividiu. 
 
 Devemos relembrar que o corpúsculo 
polar é gerado na divisão celular entre 
prófase e metáfase que forma duas 
células filhas não idênticas, sendo uma 
grande e outra pequena que é chamada 
de corpúsculo polar. 
Nas imagens acima podemos ver ovócitos na 
placa de Petri. Os ovócitos indicados por uma 
seta preta estão com o primeiro corpúsculo polar 
que é possível ser visualizado. Os ovócitos com boa 
expansão da corona radiata e presença de 1º 
corpúsculo polar devem ser mantidos enquanto 
os que não tiveram esse desenvolvimento devem 
ser descartados. 
 
 Oócitos escurecidos não são 
necessariamente ruins. A coloração 
mais escura mostra apenas que há uma 
alta quantidade de lipídeos que 
contribuem no desenvolvimento do 
embrião. Porém quando a coloração é 
heterogênea (partes escuras e partes 
não escuras) pode significar sinais de 
degeneração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Fecundação In Vitro (FIV) 
É uma etapa muito complexa já que é muito 
importante simular aos gametas o ambiente 
que haveria naturalmente. 
In vivo, a fecundação ocorre na tuba uterina 
com a chegada dos espermatozoides 
passando por um processo chamado de 
CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA que consiste em dois 
eventos necessários para que haja a 
fecundação: REAÇÃO ACROSSOMAL que é 
quando as enzimas presentes no acrossomo 
(ponta do espermatozoide) são liberadas 
sendo importantes para digerir a zona 
pelúcida do ovócito permitindo sua 
passagem e o segundo ponto é a 
HIPERATIVAÇÃO METABÓLICA DO 
ESPERMATOZOIDE, ou seja, o metabolismo 
aumenta auxiliando na perfuração e 
entrada no oócito. A capacitação 
espermática é induzida pelas substancias 
secretadas pelas células da granulosa e da 
tuba uterina., ou seja, o próprio aparelho 
reprodutivo da fêmea auxilia na capacitação 
do espermatozoide. 
 
In vitro, os espermatozoides vindos são 
descongelados e preparados envolvendo 
separação dos espermatozoides vivos dos 
mortos para então ser colocado na placa de 
Petri. 
Separação dos SPTZ 
MIGRAÇÃO ASCENDENTE (SWING UP) 
Os espermatozoides ficam em um tubo em 
que há inserção de uma substância 
separadora (TALP/ Percoll) é levado a uma 
centrífuga e a substancia irá separar os 
espermatozoides vivos dos mortos. 
 
1. SUBSTÂNCIA: PERCOLL 
Espermatozoides viáveis ficam no fundo do 
tubo. 
 
2. SUBSTÂNCIA: TALP 
Espermatozoides vivos e viáveis sobem e 
serão encontrados em cima. 
 
 
 
 
 
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In vitro são adicionados substancias 
capacitantes nos espermatozoides: como 
glocosaminoglicano e heparina. 
 
 
É necessário então uma nova placa de Petri 
em que será inserido um meio + oócitos + 
espermatozoides capacitados. A placa é 
então colocada novamente na estufa de 6 a 
22 horas. 
 
Saberemos que os oócitos foram fecundados 
por conta da liberação do 2º corpúsculo 
polar como vemos nas imagens abaixo. 
Como as imagens são de microscopia 
eletrônica é possível observar até os dois prós 
núcleos: feminino e masculino. 
 
Os ovócitos que tem somente um corpúsculo 
polar devem ser descartados. 
 
Cultivo in vitro (CIV) 
A partir da fecundação, forma-se o 
embrião. Devemos esperar seu 
desenvolvimento até chegar no estágio ideal 
para ser inserido na fêmea. 
 
 
 
Nessa fase é necessária uma nova placa de 
Petri, inserir o meio de cultivo embrionário 
e coloca-la na estufa. As avaliações devem 
ser diárias para ter um melhor 
monitoramento do desenvolvimento dos 
embriões. É comum ao passar dos dias, 
alguns embriões ficarem pelo caminho. 
Embriões mortos são descartados. 
 
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Além de avaliar o estagio de 
desenvolvimento de embrião, avaliamos 
também sua qualidade. 
(embrião fiv nunca será da mesma qualidade 
como um in vivo). 
 
GRAU 1: EMBRIÃO EXCELENTE/BOM 
 
• O desenvolvimento do embrião é 
compatível com o esperado; 
• A massa embrionária é simétrica e 
esférica com coloração e tamanho 
uniformes; 
• Zona pelúcida intacta; 
• Menos de 15% de células extrusadas. 
 
 Células extrusadas são células que não 
seguiu a sequência de 
desenvolvimento corretamente. 
 
GRAU 2: REGULAR 
 
• O desenvolvimento atende o esperado; 
• Há irregularidadesmoderadas na forma 
geral da massa embrionária, cor e 
densidade; 
• Zona pelúcida pode estar intacta ou não; 
• Mais de 15% do total de células estão 
extrusadas. 
• Ultimo estágio que pode ser congelado 
 
GRAU 3: EMBRIÃO POBRE 
 
• Desenvolvimento não é compatível com o 
esperado; 
• Há irregularidades maiores na forma, 
tamanho, cor, densidade; 
• 50% da massa embrionária é viável; 
• Mais de 75% das células estão 
degeneradas. 
• É o ultimo grau a ser inserido na 
receptora a fresco. 
 
GRAU 4: EMBRIÃO DEGENERADO OU MORTO 
 
• Desenvolvimento não é compatível com o 
esperado; 
• Possui apenas 25% da massa 
embrionária viável; 
• Há irregularidades maiores na forma, 
tamanho, cor e densidade; 
• Massa embrionária é menor que 25% de 
todo o material presente na zona 
pelúcida. 
 
 
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Os embriões a serem transferidos, 
normalmente estão na fases de mórula 
compacta a blastocisto (até dia 8). 
Podemos transferir a fresco ou congelar os 
embriões, porém, como já mencionado, 
congelação é danoso às células, mas a maior 
parte dos embriões são congelados por uma 
questão de logística. Há então a vitrificação 
que é uma congelação super rápida. 
 
A transferência de embriões FIV é feita da 
mesma forma que o TE. Por meio da 
inovulação. 
Inovulação 
É a transferência não cirurgica via vaginal. 
Para ser realizada é necessário sincronizar a 
receptora com a doadora sendo o ideal que 
a receptora manifeste estro junto com a 
doadora ou em intervalo de 24 horas. 
Antes de inserir o embrião, deve-se avaliar 
a receptora e verificar, por meio de 
palpação retal ou ultrassom se há a 
formação de um corpo lúteo e sua qualidade 
(quanto maior, melhor). 
 
Após a avaliação, devemos então preparar o 
material para o procedimento que consiste 
em 
• INOVULADOR FRANCÊS OU ALEMÃO: 
semelhante a uma palheta de 
inseminação, porem mais fino e 
comprido já que o embrião deve ser 
inserido no corno uterino. Por cima do 
inovulador é colocada a bainha azul que 
é uma estrutura firme e estéril que 
protege e dá a limpeza evitando a 
contaminação; 
 
 
• CAMISA SANITÁRIA: plástico que evita a 
entrada de sujidades no ambiente 
uterino. – nem todos os veterinários 
utilizam. 
 
Devemos então fazer a limpeza de reto e 
higiene da receptora para iniciar o 
procedimento. 
 Alguns veterinários optam por 
realizar uma anestesia epidural para 
que as fêmeas fiquem mais calmas, 
mas o procedimento é rápido e pode 
ser realizado sem a anestesia. 
 
O inovulador é inserido via vaginal e com o 
auxílio da palpação retal, é direcionado para 
 
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a junção útero-tubárica, na ponta do corno 
uterino ipsilateral (mesmo lado) ao corpo 
lúteo. 
 
Caso o embrião esteja congelado, ele deve 
ser descongelado ao mantermos durante 10 
segundos no ar evitando que os cristais de 
gelo fraturem a zona pelúcida, e 20 
segundos em água a 25ºC. 
 
 
 
Devemos então aguardar alguns dias e 
realizar então o diagnostico de gestação, 
podendo ser de forma precoce (25 dias) com 
o auxílio do ultrassom ou por palpação retal 
(45 a 60 dias) em que será possível sentir a 
assimetria dos cornos uterinos. 
 
A sexagem poderá ser realizada de 50 a 70 
dias.