Princípios Metodológicos em Imunologia Clínica

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Princípios Metodológicos em Imunologia Clínica 
 
 
 
 Base para os ensaios clínicos: 
 
Ag +Ac = Ac – Ag 
 
 Anticorpos não podem ser 
visualizados 
-> reações evidenciam sua presença; 
 
 Detecção de: 
- Anticorpos específicos INDIRETA – 
emprega-se antígenos reagentes; 
- Antígenos DIRETA – emprega-se de 
anticorpos (reagentes). 
 
 Testes sorológicos cada vez mais 
refinados; 
 
 Sensibilidade e Especificidade; 
 
 Objetivo: pesquisar Ac e Ag; 
 
 Várias metodologias disponíveis. 
 
 
 
 
1) Reagentes não marcados: 
 
- Reação de aglutinação; 
 
- Reação de precipitação. 
 
2) Reagentes marcados: 
 
- RIA; 
 
- Imunofluorescência; 
 
- ELISA; 
 
- Quimioluminescência; 
 
- Western Blotting. 
 
 
 
 
 Caracteriza-se pela formação 
de agregados visíveis como resultado 
da interação de anticorpos específicos e 
partículas insolúveis que possuem 
determinantes antigênicos em sua 
superfície: 
 
- Antígenos: Hemácias, bactérias, 
protozoários; 
 
- Partículas inertes: látex, poliestireno, 
bentonita; 
 
 
 
 Antígeno tem natureza insolúvel; 
 
 
 As hemácias estão entre os 
melhores suportes para aglutinação: 
 
Potencial Zeta: potencial de repulsão 
das hemácias; 
 
– Meios potencializadores (redução de 
potencial zeta). 
 
Imunoensaios 
Métodos imunológicos 
Aglutinação 
 Qualitativo 
 
 Semi-quantitativo: 
 
- Título: maior diluição que ainda causa 
aglutinação, pode ter fator de conversão 
ou não. 
 
 
 
 
. Soros: 
 
 
 Amostra (antígenos eritrocitários); 
 
 Reagentes. 
 
 
 Um resultado positivo é indicado 
por uma aglutinação visível 
(aglomeração dos eritrócitos). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Diferentes metodologias; 
 
 Prova reversa – grupo sanguíneo 
ABO : 
 
- Anticorpos ABO presentes naturalmente 
nos indivíduos contra antígenos que eles 
não possuem nas hemácias. 
 
 
 
 
 Pesquisa e identificação de 
anticorpos contra antígenos 
eritrocitários/hemácias; 
 
 Capacidade do Anticorpo de 
sensibilizar as hemácias mas na 
incapacidade de aglutiná-las; 
Tipagem sanguínea 
Teste de Coombs 
 
 Soro de Coombs (anti-IgG 
humana). 
 
 O soro de antiglobulina humana 
foi sintetizado a partir da sensibilização 
de animais (cabras ou coelhos) com 
injeções de imunoglobulinas humanas, 
ocorrendo assim a produção de 
anticorpos contra as frações Fc dessas 
imunoglobulinas; 
 
- Soro de Coombs ou soro de 
Antiglobulina Humana (AGH). 
 
 Teste de Coombs Indireto: 
 
- Detecta anticorpos que estão livres no 
soro (não estão ligados as hemácias); 
 
- Muito utilizado no pré-natal de mães Rh 
negativas. 
 
 
 
 
 
 Teste de Coombs Direto: 
 
- Pesquisa de anticorpos adsorvidos nas 
hemácias do paciente “in vivo”; 
 
- Anemias hemolíticas autoimunes ou por 
medicamentos, doença hemolítica do 
recém‑nascido. 
 
 
 
 
 
 
 PCR – Proteína C reativa: 
 
 
- Produzida pelo fígado; 
 
- Concentração no sangue eleva 
consideravelmente quando ocorre algum 
processo inflamatório: infecções, traumatismos, 
doenças reumáticas e neoplasias. 
 
- Pode ocorrer Efeito Pós ZONA. 
 
 ASLO - anticorpo antiestreptolisina O 
 
- Anticorpo que identifica a presença de uma 
proteína presente no Estreptococo beta 
hemolítico do grupo A. 
 
Exemplos testes na prática laboratorial 
- amigdalite, escarlatina, erisipela, 
glomerulonefrite e febre reumática. 
 
 Fator reumatoide (FR) 
 
É utilizado principalmente para 
diagnosticar artrite reumatóide e auxiliar 
a diferenciá-la de outras formas de 
artrite ou outras doenças/estados clínicos 
que provocam sintomas semelhantes. 
 
 VDRL: Triagem para Sífilis 
 
- Reagente: Suspensão antigênica de 
cristais de colesterol sensibilizado com 
lecitina e cardiolipina; 
 
- Detecção de Anticorpos anti-
fosfolipídeos; 
 
- Floculação (tipo particular de 
aglutinação). 
 
 
 
 
 
 
 
 É uma técnica para a detecção 
de anticorpos específicos que, quando 
presentes, reconhecerão antígenos na 
superfície de eritrócitos, causando 
aglutinação. 
 
Hemaglutinação para a Doença de 
Chagas 
 
- Hemácias são revestidas com Ag do T. 
cruzi; 
 
- Em placa de microtitulação. 
 
 
 
- Positivo: hemácias se aglutinam e 
formam uma camada no fundo do poço. 
 
- Negativo: Não existe Ac específico, as 
células formam um botão no fundo do 
poço. 
 
 
 
 
 Interferentes: 
 
- “Tempo de leitura”: Reações por mais 
tempo podem causar resultados falsos 
devido aos efeitos de secagem; 
 
- Controles Positivo/Negativo; 
 
- Soros fortemente lipêmicos e 
hemolisados produzem aglutinação 
inespecífica; 
 
 
 
 Combinação de antígeno solúvel com 
anticorpo solúvel para produzir 
complexos insolúveis que são visíveis. 
 
 Visualização dos precipitados: 
 
- Meio líquido – difícil 
 
- Meio geleificado ou automação 
 
. Precipitação máxima na zona de 
equivalência – quantidades de antígeno 
e anticorpo são equivalentes. 
Hemaglutinação 
Aglutinação 
Precipitação 
 Imunodifusão 
 
- Difusão de substâncias solúveis por 
movimentos moleculares ao acaso em 
meio geleificado como ágar ou gel 
agarose; 
 
- Enquanto as moléculas estão livres 
continua ocorrendo difusão até que se 
formam imunocomplexos de elevado 
peso molecular; 
 
- Devido o tamanho ficam imobilizados 
no gel, permitindo visualização. 
 
 Imunodifusão Radial ou Simples 
 
- Nesta técnica o anticorpo é 
uniformemente distribuído no gel e o 
antígeno (amostra teste) é aplicado em 
um orifício; 
 
- Antígeno se difunde de acordo com seu 
tamanho molecular e encontra o 
anticorpo imobilizado no gel; 
 
- Formando um halo de precipitação 
circular em torno do orifício da amostra. 
 
 
 
Utilização: Dosagem de IgG, IgA e IgM 
e proteínas séricas; 
 
Pouco utilizado na prática clínica; 
 
- Teste Quantitativo - diâmetro do halo 
de precipitação formado é proporcional 
à concentração do analito pesquisado 
na amostra. 
 
 Imunodifusão Dupla 
 
 
 
- Antígeno desconhecido e moléculas de 
um anticorpo poliespecífico são colocados 
a difundir em um meio suporte; 
 
- As soluções sofrem difusão e, quando o 
Ag e o Ac se encontram em zona de 
equivalência, se observa a reação pela 
formação de uma linha de precipitação. 
 
Utilização: pesquisa e diagnóstico de 
algumas doenças, como Cisticercose. 
 
Pouco utilizado na prática clínica. 
 
 Imunoeletroforese 
 
- Combina a eletroforese em gel, seguida 
da imunodifusão e precipitação das 
proteínas. 
 
- Eletroforese, ocorre a migração de 
partículas carregadas em um solvente 
condutor sob a influência de um campo 
elétrico. 
 
- As moléculas migram, distribuindo-se no 
gel de acordo com os seus PM e cargas 
elétricas; 
 
- Uma canaleta é recortada entre os 
poços e preenchida com Ac, que se 
difunde; 
 
- Ag e Ac formam arcos de precipitação. 
 
 
 
- Método qualitativo aplicável a qualquer 
substância solúvel imunogênica cujos 
anticorpos sejam precipitantes. 
 
- Pode ser utilizada: 
 
. Detectar a ausência ou a diminuição de 
imunoglobulinas que ocorrem em 
imunodeficiências; 
 
. Identificar cadeias leves na urina de 
pacientes com discrasias ou doenças 
autoimunes; 
 
. Detectar a natureza monoclonal da 
proteína de Bence Jones no mieloma; 
 
. Identificar aumentos na quantidade de 
proteínas no liquor em doenças 
neurológicas, etc.