Sequenciamento Genético

Prévia do material em texto

Rafael Augusto @rafael.augustor 
Sequenciamento do Genoma 
→ Genoma é toda informação genética de um 
organismo 
→ Genoma nuclear (cromossomos) – inclui 
regiões codificadoras e não codificadoras 
→ Genoma Mitocondrial (as mitocôndrias 
dentro da célula também possuem DNA) 
→ Genoma de plasmídeos, cloroplastos 
→ Alelo: versões de sequências diferentes que 
representam o mesmo gene 
 Por que sequenciar um genoma? 
É primeiro passo para obter uma descrição 
completa da composição molecular de cada 
organismo – pois todas as informações 
necessárias para a construção estão presentes 
no DNA genômico. 
Comparação de genomas de diversos indivíduos 
permitira correlacionar características e 
síndromes com mutações de determinados locus 
do genoma 
O início do sequenciamento de um genoma 
inicia de modo semelhante ao PCR. 
O sequenciamento ocorre por 
complementariedade da fita, sendo necessário a 
abertura prévia da fita em questão para 
identificar as bases que compõe o DNA. 
O sequenciamento determina a ordem precisa 
do DNA sendo, portanto, o mais ideal quando a 
ideia é entender a sequência exata e não apenas 
a presença de determinado gene ou sua 
ampliação como na técnica de PCR 
 Tecnologias de Sequenciamento de DNA 
Sequenciamento de Primeira Geração 
• Interrupção de cadeia – Sanger 
 A técnica assemelha-se ao PCR com um 
processo de eletroforese posterior. 
 Há a presença de primers iniciadores 
 Utilização de um nucleotídeo modificado 
(ddNTP) – presença de um H no lugar de uma 
OH (ocorre no terceiro Carbono) 
 
 Existem ddNTP para as quatro bases 
 Durante o processo de replicação, a 
extensão da cadeia para ao entrar um ddNTP 
e com isso a cadeia para de sequenciar a fita. 
 Esse fenômeno ocorre devido à presença 
do H que impossibilita a ligação fosfodiéster 
do ddNTP com o próximo nucleotídeo 
 
 Divide-se em porções e adiciona todos os 
nucleotídeos. Assim, um deles é modificado e 
toda vez que for sua posição ele entrará e 
parará a sequência possibilitando saber que 
ali é o lugar da base em questão. 
 Para que o processo dê certo são feitas 
em milhares a fim de que o ddNTP possa 
ocupar lugar em outras sequencias quando 
for para se ligar em porções mais distantes 
da sequência. Desse modo é preciso que 
além do modificado haja o normal, como 
exemplo num ddNTP para guanina há ela 
modificada e normal para que o máximo de 
possibilidades sejam montadas. 
 Após isso, é colocado na eletroforese. 
Aquele fragmento que houve menos 
nucleotídeos ligados fica mais leve, portanto, 
significa que a cadeia parou de ser montada 
logo no início, valendo o oposto para os 
maiores que receberão mais nucleotídeos e 
serão longas cadeias 
 Para finalizar, juntam-se todos e é 
realizada a leitura geral debaixo para cima, 
pois o início é mais leve do que as cadeias 
mais longas que são as mais pesadas. 
 
 
Vídeo Método de Sanger: 
https://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWjD
wes 
 Atualmente, esse sequenciamento é 
feito de forma automatizada, então a cada 
https://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWjDwes
https://www.youtube.com/watch?v=6ldtdWjDwes
Rafael Augusto @rafael.augustor 
ddNTP modificado é possível ver seu 
comprimento de onda que emite uma luz 
através dos marcadores com fluorocromos e 
assim é possível achar sua posição. 
 
 
• New Generation Sequences (NGS) 
Torna o ato de sequenciar mais barato por 
base sequenciada, possibilitando o 
sequenciamento de grandes sequencias e de 
forma a mais rápida 
Não há ddNTP, logo não há pausa como no 
método de Sanger. Então a pausa da formação 
da cadeia, sendo todos os nucleotídeos 
presentes na técnica marcados por 
fluorocromos (florescência associada ao 
nucleotídeo por comprimento de onda 
específico) 
Ocorre a ampliação da quantidade de DNA, a 
fim de criar um volume necessário para 
estatisticamente afirmar a acurácia do 
processo. 
Mais vantagens que o método de Sanger, pois 
a fita é sequenciada enquanto é sintetizada. 
Método NGS: 
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HR
aZ8 
Genômica Pessoal 
Estudo do genoma de um indivíduo com foco 
em compreender suas características e criar 
uma medicina preventiva e curativa focada em 
tratamentos realmente eficazes.