Relatório bioquímica - Captação de glicose por células em cultivo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE - ICBS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
DISCIPLINA CBS01020: BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 1 (ERE) 
CAPTAÇÃO DE GLICOSE POR CÉLULAS EM CULTIVO 
 
 
 
 
 
 
 
ANA CAROLINA SULZBACH 
LEONARDO MACHADO POOTER 
TAINÁ SCHONS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PORTO ALEGRE, AGOSTO DE 2021. 
 
1. INTRODUÇÃO 
As células utilizam a glicose como uma das principais fontes para obtenção de energia 
e como precursor para síntese de biomassa. Para tal, transportadores de glicose (GLUT) 
existem constitutivamente na membrana plasmática (ex: GLUT1) ou são direcionados por 
ação hormonal (ex: insulina e o GLUT4) em células responsivas (células musculares, 
adipócitos). Células tumorais, devido à reprogramação metabólica, apresentam grande 
capacidade de captação de glicose para dar suporte à via glicolítica e de biossíntese. Os 
transportadores de glicose podem ser inibidos por drogas antimetabólicas, como a floretina. 
 
2. OBJETIVO 
Analisar a taxa de consumo (captação) de glicose por adipócitos e células de câncer 
de pulmão em cultivo, o efeito da insulina e de um inibidor por 24h. 
 
3. METODOLOGIA 
 
3.1 Princípio do Método (Bioliquid - Laborclin) 
 A glicose residual do sobrenadante das amostras é convertida pela glicose oxidase 
em ácido glicônico e H2O2, que na presença de uma peroxidase oxida o sistema cromogênio 
(4-aminoantipirina e fenol) a um composto de cor vermelha cuja intensidade de cor é 
proporcional à concentração de glicose na amostra. 
 
Glicose + O2 + H2O ® ácido glicônico + H2O2 (catalisada pela Glicose Oxidase) 
4-aminoantipirina + fenol + 2H2O2 ® complexo corado vermelho (Peroxidase) 
 
3.2 Preparação das amostras (sobrenadante do meio de cultivo) 
 Nessa prática analisaremos a taxa de consumo (captação) de glicose por adipócitos 
(linhagem 3T3 de pré-adipócitos diferenciados) e células de câncer de pulmão (EKVX) em 
cultivo (1 x 106 células), o efeito da insulina (0.4 µM) e de um inibidor (insulina 0.4 µM e 
floretina 0.5 mM) por 24h. Temos como grupos amostrais os sobrenadantes dos seguintes 
cultivos: 
 
- A1 e A2: 3T3 basal (t0 e t24h); 
- A3 e A4: 3T3 + Ins (t0 e t24h); 
- A5 e A6: 3T3 + Flo (t0 e t24h); 
- A7 e A8: EKVX basal (t0 e t24h); 
- A9 e A10: EKVX + Ins (t0 e t24h); 
- A11 e A12: EKVX + Flo (t0 e t24h) 
 
3.3 Dosagem colorimétrica da concentração de glicose e a taxa de captação 
 
- Pipetar, de acordo com a tabela abaixo, o branco (B), a curva padrão de glicose (10 mg/dL) 
(P1, P2, P3 e P4) e as amostras (A1 a A12): 
 
 
 
TUBO Solução Padrão (µL) Amostra (µL) H2O (µL) Reativo (µL) 
B - - 50 200 
P1 5 - 45 200 
P2 10 - 40 200 
P3 20 - 30 200 
P4 40 10 200 
A1 - 10 40 200 
... - 10 40 200 
 - 10 40 200 
A12 10 40 200 
 
- Agitar os tubos e incuba-los a 37°C por 15 min; 
- Ler as absorbâncias em 500-520 nm, utilizando o valor de B para descontar das demais 
leituras; 
 
4. RESULTADOS 
4.1 Absorbâncias obtidas em 515 nm: 
Amostras Absorbâncias 
Branco (já foi descontado) 0.002 
1 0.035 
2 0.082 
3 0.13 
4 0.311 Amostras Absorbâncias 
A1 (3T3 Basal) t0 0.307 A7 (EKVX Basal) t0 0.309 
A2 (3T3 Basal) t24 0.279 A8 (EKVX Basal) 
t24 
0.083 
A3 (3T3 Insulina) t0 0.309 A9 (EKVX Insulina) 
t0 
0.308 
A4 (3T3 Insulina) t24 0.211 A10 (EKVX 
Insulina) t24 
0.053 
A5 (3T3 Floretina) t0 0.308 A11 (EKVX 
Floretina) t0 
0.307 
A6 (3T3 Floretina) t24 0.299 A12 (EKVX 
Floretina) t24 
0.293 
 
4.2 Cálculo do FCM da curva padrão e glicose nas amostras (µg/µL): 
 
Sabendo-se que a solução padrão é (10 mg/dL), primeiramente os valores serão 
transformados para que todos estejam em µg/µL. Os 10mg/100mL da solução padrão de 
glicose equivalem a 0,1µg/µL, sendo assim, os cálculos dos valores referentes aos tubos de 
amostra seguem: 
Branco 0 
P1 5µL*0,1µg/µL = 0,5µg 
P2 10 µL*0,1µg/µL = 1µg 
P3 20 µL*0,1µg/µL = 2µg 
P4 40 µL*0,1µg/µL = 4µg 
 
 
 
Em seguida, calcula-se o valor de FCP (quantidade/abs), para posterior cálculo de 
FCM (média entre os FCP): 
P1 0,5µg/0,035 = 14,28µg 
P2 1µg/0,082 = 12,19 µg 
P3 2µg/0,13 = 15,38 µg 
P4 4µg/0,311 = 12,86 µg 
 
FCM: (14,28 + 12,19 + 15,38 + 12,86)/4 
FCM= 13,67µg
 
 
Em seguida, usa-se o valor de FCM calculado posteriormente, para calcular a 
quantidade de glicose (em 10µL) nas amostras celulares: 
A1: 13,67µg*0,307= 4,19µg 
A2: 13,67µg*0,279= 3,81µg 
A3: 13,67µg*0,309= 4,22µg 
A4: 13,67µg*0,211= 2,88µg 
A5: 13,67µg*0,308= 4,21µg 
A6: 13,67µg*0,299= 4,087µg 
A7:13,67µg*0,309 = 4,22µg 
A8:13,67µg*0,083 = 1,13µg 
A9:13,67µg*0,308 = 4,21µg 
A10:13,67µg*0,053 = 0,72µg 
A11:13,67µg*0,307 = 4,19µg 
A12:13,67µg*0,293 = 4µg
 
 
 
 
 
Como essa quantidade é calculada para os 10µL de solução padrão de glicose que 
foram pipetados, para que se expresse o valor em 1µL, deve-se dividir os valores por 10, para 
encontrarmos a concentração final de glicose nas amostras: 
 
A1 (3T3 Basal) t0: 4,19µg/10µL = 0,419µg/µL 
A2 (3T3 Basal) t24: 3,81µg/10µL = 0,381µg/µL
A3 (3T3 Insulina) t0: 4,22µg/10µL= 0,422µg/µL 
A4 (3T3 Insulina) t24: 2,88µg/10µL= 0,288µg/µL 
A5 (3T3 Floretina) t0: 4,21µg/10µL= 0,421µg/µL 
A5 (3T3 Floretina) t24: 4,08µg/10µL= 0,408µg/µL 
 
A7 (EKVX Basal) t0: 4,22µg/10µL = 0,422µg/µL 
A8 (EKVX Basal) t24: 1,13µg/10µL = 0,113µg/µL 
A9 (EKVX Insulina) t0: 4,21µg/10µL = 0,421µg/µL 
A10 (EKVX Insulina) t24: 0,72µg/10µL = 0,072µg/µL 
A11 (EKVX Floretina) t0: 4,19µg/10µL = 0,419µg/µL 
A12(EKVX Floretina) t24: 4µg/10µL = 0,4µg/µL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Gráficos representativos da concentração 
de glicose nas células 3T3 e EKVX, no t0 e t24. 
 
 
 
 
 
 
 
4.3 Cálculo da taxa de captação (consumo) de glicose: 
 
 Taxa de Captação de Glicose: (t0 – t24).h-1.106 células 
Taxa Basal 3T3: 
=0,419-0,381=0,038µg/µL em 24h 
= 0,00158 (µg/µL)/h/106 células 
 
Taxa Floretina 3T3: 
= 0,421- 0,408= 0,013/24h 
= 0,000541 (µg/µL)/h/106 células 
 
Taxa Insulina 3T3: 
= 0,422 - 0,288 = 0,134/24h 
= 0,00558 (µg/µL)/h/106 células 
 
Taxa Basal EKVX: 
= 0,422 - 0,113 = 0,309/24h 
= 0,012875 (µg/µL)/h/106 células 
 
Taxa Floretina EKVX: 
= 0,419 - 0,4µg/µL = 0,019/24h 
= 0,000791 (µg/µL)/h/106 células 
 
Taxa Insulina EKVX: 
= 0,421 - 0,072 = 0,349/24h 
= 0,01454 (µg/µL)/h/106 células
 
4.4 Cálculo, em %, do quanto de glicose foi consumido ao longo das 24h: 
 
 Basal 3T3: 
 0,419 - 100% 
 0,038 - x = 9% - consumiu 9% de glicose durante 24h. 
 Insulina 3T3: 0,134*100/0,422 = 31,75% de glicose foi consumida em 24h. 
Floretina 3T3: 0,013*100/0,421= 3% de glicose foi consumida em 24h. 
 
 Basal EKVX: 0,309*100/0,422 = 73% de glicose foi consumida em 24h. 
 Insulina EKVX: 0,349*100/0,421= 82,9% de glicose foi consumida em 24h. 
Floretina EKVX: 0,019*100/0,419 = 4,5% de glicose foi consumida em 24h. 
 
 
5. DISCUSSÃO 
Um ponto importante a ser analisado, são as diferenças entre a dependência e a não 
dependência que as células têm dos transportadores, além da influência da insulina no 
processo. Como se sabe, o transporte da glicose pode acontecer tanto por difusão passiva, 
quanto por transporte ativo, através dos GLUTs, os transportadores específicos da glicose. 
Uma vez dentro da célula, a insulina consome essa glicose para transformá-la em energia. 
Nas amostras de adipócito basal (3T3), podemos ver que houve um consumo de 9% da 
glicose em 24h, mas na amostra de célula tumoral basal (EKVX), esse consumo decola para 
um valor de 73% de consumo, o que já pontua uma coisa importante: células tumorais 
consomem muito mais glicose que uma célula comum, principalmente por não serem 
dependentes de insulina no que diz respeito ao transporte da glicose. 
Ademais, é possível analisar, nas amostrasque contêm insulina, a influência desse 
hormônio, uma vez que ambos os consumos de glicose – no adipócito e na célula tumoral - 
estão mais altos. Além disso, vemos que as amostras que contêm a droga antimetabólica 
Floretina possuem decaídas significativas em seus consumos de glicose. Isso se deve ao fato 
da Floretina ser um inibidor dos transportadores de glicose, os GLUTs. Sendo assim, o 
consumo cai, pois o único meio disponível para a glicose entrar na célula (uma vez que os 
GLUTs estão “inativados” pela Floretina) é por difusão facilitada. Então, observou-se que a 
diferença entre os consumos nas amostras basais e nas amostras com Floretina representam 
o que foi consumido por difusão passiva, ou seja, representam a captação da glicose 
independente de transportadores. 
 
 
Figura 2. Gráfico representando a taxa de consumo de glicose em 24h, nas células 3T3 e EKVX, em cada 
tratamento (Basal, Insulina e Floretina). 
 
6. CONCLUSÃO 
Dessa forma, podemos concluir que as células tumorais consomem mais glicose, 
quando comparadas com as células 3T3 e que a Floretina diminui esse consumo em ambas 
as células. Além disso, observamos também que a insulina colabora para um aumento no 
consumo de glicose, tanto nas células 3T3 como EKVX. 
 
7. REFERÊNCIAS 
 
Nelson, DL.; Cox, MM. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 
2014.