Relatório de Imunologia

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DA AMAZÔNIA – UNAMA/SANTARÉM
CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
IMUNOLOGIA
Dalcilene Silva Pereira - 04035220
Mirlene Nascimento de Jesus - 04035670
Roberta Liviane da Silva Picanço - 04055601
Wandrea Dilamar Vasconcelos Pinto - 04035861
AULA PRÁTICA
Profa. Esp. Isabele de Azevedo Portela Almeida.
SANTARÉM
2021
1. INTRODUÇÃO
	Na aula prática de imunologia desenvolvemos as técnica de tipagem sanguínea – lamina e tubo; teste rápido – HCG; teste de aglutinação – VDRL; teste de aglutinação – PCR; teste de aglutinação – FR; teste de aglutinação – AEO (ASO). O sistema ABO, é representado por quatro grupos principais, A, B, AB e O. Um dos testes mais importantes em imuno-hematologia é a tipagem sanguínea, com pesquisa de antígenos presentes na membrana do eritrócito e anticorpos livre no soro. Vários métodos estão disponíveis para fenotipagem eritrocitária, como por exemplo, tipagem em lâmina, tubo, gel, microplaca e genotipagem. Entretanto, o método em lâmina é o que apresenta maior difusão na rotina laboratorial de análises clinicas, por ser de fácil execução, rápido e barato. 
	O teste rápido HCG, é um importante marcador bioquímico hormonal glicoproteico, constituído de duas subunidades: alfa (α) e beta (β). Conhecido como o “hormônio da gravidez” é responsável pela atividade secretora do corpo lúteo, fundamental na fase inicial da gestação. O teste VDRL, é um teste laboratorial que permite a identificação de pacientes portadores da sífilis, uma doença de transmissão sexual, causada pela espiroqueta Treponema pallidium. 
	A proteína C-reativa (PCR) é uma proteína produzida pelo fígado e está presente em pequenas quantidades no plasma de pessoas hígidas. No entanto, sua concentração circulante pode aumentar drasticamente em uma resposta mediada por processos inflamatórios e infecciosos. O teste de aglutinação – FR baseia-se na aglutinação das partículas de látex sensibilizadas com gama-globulina humana (antígeno), quando misturadas com soro de pacientes contendo fatores reumatóides (FR). O teste AEO baseia-se na aglutinação das partículas de látex sensibilizadas com estreptolisina O (antígeno), quando misturadas com soro de pacientes contendo anticorpos específicos devido a infecção por estreptococos beta -hemolíticos dos grupos Ae C produtores de estreptolisina O.
2. OBJETIVOS
· Realizar teste de tipagem sanguínea em lamina. 
· Realizar diagnóstico de gravidez através da pesquisa de HCG. 
· Detectar anticorpos inespecíficos, não treponemicos, presentes no soro de pacientes com infecção sifilítica.
· Fazer a detecção de proteína C reativa no soro de pacientes.
· Diagnosticar artrite reumatoide.
· Realizar pesquisa de anticorpo contra estreptolisina O.
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1 TIPAGEM SANGUÍNEA 
Vidrarias: Tubos de ensaio e laminas.
Reagentes e Soluções: 01 ANT –A, 02 ANT – B, 03 ANT –AB. 
Matéria-prima: amostra sangue com EDTA. 
Equipamento: micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Procedimento: 
Teste em lâmina: Preparar uma suspensão de glóbulos a 40% no próprio soro, plasma ou solução salina à 0,9%. Colocar uma gota do reagente Anti-A no lado esquerdo da lâmina e uma gota de reagente Anti-B no lado direito. Em uma segunda lâmina, colocar uma gota de reagente Anti-AB. Realizar os testes à temperatura ambiente (20º a 25º C). Adicionar 1 gota da suspensão de hemácias a cada reagente. Misturar o reagente com a suspensão de glóbulos em uma área de 2x3 cm. Movimentar delicadamente a lâmina para promover a mistura e examinar a presença ou não de aglutinação macroscópica. A aglutinação se inicia em poucos segundos. Não observar a lâmina por mais de 2 minutos, quando não houver aglutinação. Alternativamente, pode-se realizar o teste em lâmina utilizando-se uma suspensão de glóbulos à 10% em solução salina à 0,9%.
Teste em tubo: Preparar uma suspensão a 3-5% do glóbulo a ser testado em solução salina à 0,9%. Adicionar uma gota de reagente Anti-A, Anti-B e Anti-AB respectivamente em três tubos de ensaio e identificá-los. Acrescentar uma gota da suspensão de hemácias 3-5% a cada tubo. Misturar bem o conteúdo. Centrifugar por 15 segundos a 3400 rpm. Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e examinar a presença ou não de aglutinação. Graduar e registrar o resultado. A força centrífuga aplicada deve ser a mínima necessária para se obter um sobrenadante claro e um botão. nitidamente delineado que possa ser ressuspendido facilmente.
3.2 TESTE RÁPIDO - HCG.
Reagentes e Soluções: kit betatest plus
Matéria-prima: amostra do paciente.
Equipamento: micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Procedimento: As placas e as amostras devem estar entre 15 – 30 °C no momento da realização do teste. Remover a placa de reação do envelope protetor, identificá-la adequadamente e colocá-la em uma superfície horizontal. Adicionar 5 gotas (0,2mL) da amostra no orifício da placa de reação, disparar o cronômetro, aguardar 5 (cinco) minutos e realizar a leitura do teste. Esperar que as linhas coloridas apareçam. Dependendo da concentração de hCG na amostra, pode-se encontrar resultados positivos em 1 minuto. Entretanto negativos devem ser confirmados somente quando se completar o tempo exato de cinco minutos. Após este tempo não deve haver interpretação de resultado. 
Interpretação dos resultados. Um resultado positivo (aparecimento da linha na posição teste) só deve ser interpretada no máximo até cinco minutos após o início do teste. Entretanto, a linha controle pode tornar-se visível posteriormente, entre 5 e 10 minutos. 
Negativo: Ocorre a formação de uma linha colorida na posição de controle e ausência de linha colorida na posição de teste. 
Positivo: Ocorre a formação de uma linha colorida na posição teste e outra linha na posição controle. A linha na posição teste, claramente identificável até 5 minutos do início do teste, mesmo quando sua intensidade for menor que a linha na posição controle, mostra que o teste deve ser considerado positivo, indicando uma concentração de hCG igual ou maior que 25mUl/mL. Não considerar resultados positivos quando a linha na posição teste se mostrar visível depois de decorridos 5minutos do inicio do teste. A intensidade da cor da linha de teste é decorrente da concentração de hCG na amostra, mas o teste não deve ser usado para uma avaliação quantitativa ou para determinar a taxa de elevação dos níveis de hCG. Nos casos em que a linha teste se mostrar muito tênue no momento da leitura, recomenda-se que o teste seja repetido dentro de 1-2 dias, inclusive com amostras de urina. Recomenda-se manter as amostras identificadas e congeladas por um período de tempo suficiente, para que possam ser utilizadas como contra-prova. A intensidade da cor da linha de controle pode ser menor que a intensidade da cor da linha de teste, sem que isto signifique problema no desempenho do teste. 
3.3 TESTE DE AGLUTINAÇÃO - VDRL 
Vidrarias: Tubos de ensaio.
Reagentes e Soluções: REAGENTES VDRL. 
Matéria-prima: amostra sangue com EDTA. 
Equipamento: micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Teste Qualitativo: Pipetar 50μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma cavidade da placa escavada (placa de Kline). Dispensar 20μl da suspensão antigênica sobre a amostra. Colocar a placa em um agitador mecânico e agitar durante 4 minutos a 180rpm. Após quatro minutos, observar o resultado ao microscópio utilizando o aumento de 100x, comparando a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. 
Resultado Reativo: Agregados médios e grandes; Resultado Reativo Fraco: Agregados finos dispersos; Resultado Não Reativo: Ausência de agregados, aspecto homogêneo. 
Teste Semi-Quantitativo: Preparar diluições seriadas do soro (1/2,1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64) utilizando solução salina. Pipetar 50μl das amostras em uma cavidade da placa escavada. Dispensar 20μl da suspensão antigênica na mesma área da amostra. Colocar a placa em um agitador mecânico e agitardurante 4 minutos a 180rpm. Após quatro minutos, observar o resultado ao microscópio utilizando o aumento de 100x, comparando a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. Será considerado título a maior concentração da amostra que apresentar aglutinação macroscópica. 
3.4 TESTE DE AGLUTINAÇÃO - PCR 
Vidrarias: Tubos de ensaio e laminas.
Reagentes e Soluções: KIT SEROLATEX PCR. 
Matéria-prima: amostra sangue com EDTA. 
Equipamento: estantes para tubo, placa de reação ou cartão teste, micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Teste Qualitativo: Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 25μl na mesma área da amostra. Pipetar 25μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após DOIS minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparando a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 6mg/L. Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. Concentração igual ou superior a 6mg/L. A intensidade não é indicativo de concentração; para tanto, realizar o teste semi-quantitativo. 
Teste Semi-Quantitativo: Preparar diluições seriadas do soro (1/2,1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64) utilizando solução salina. Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 25μl na mesma área da amostra. Pipetar 25μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após DOIS minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparado a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. Será considerado título a maior concentração da amostra que apresentar aglutinação macroscópica. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 6mg/L. 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. A concentração de PCR será dada pelo seguinte cálculo: Concentração (mg/L) = 6 X D, onde 6 é a sensibilidade do teste e D, a maior diluição que apresenta aglutinação. EXEMPLO: Se o título obtido for 1:8, a concentração aproximada de PCR existente na amostra será: 6 x 8 = 48 mg/L. 
3.5 TESTE DE AGLUTINAÇÃO - FR 
Vidrarias: Tubos de ensaio e laminas.
Reagentes e Soluções: Kit reumalátex 
Matéria-prima: amostra sangue com EDTA. 
Equipamento: Geladeira, estante para tubos, placa de reação ou cartão teste, micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Teste Qualitativo: Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 50μl na mesma área da amostra. Pipetar 50μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após dois minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparando a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 8 UI/mL. 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. Concentração igual ou superior a 8 UI/mL. A intensidade não é indicativo de concentração; para tanto, realizar o teste semi-quantitativo. 
Teste Semi-Quantitativo: Preparar diluições seriadas do soro (1/2,1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64) utilizando solução salina. Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 50μl na mesma área da amostra. Pipetar 50μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após dois minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparado a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e cotrole negativo. Será considerado título a maior concentração da amostra que apresentar aglutinação macroscópica. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 8 UI/mL. 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. A concentração de PCR será dada pelo seguinte cálculo: Concentração (mg/L) = 8 X D, onde 8 é a sensibilidade do teste e D, a maior diluição que apresenta aglutinação. EXEMPLO: Se o título obtido for 1:8, a concentração aproximada de FR existente na amostra será: 8 x 8 = 48 UI/mL. 
3.6 TESTE DE AGLUTINAÇÃO – AEO (ASO) 
Vidrarias: Tubos de ensaio e laminas.
Reagentes e Soluções: kit serolátex
Matéria-prima: amostra sangue com EDTA. 
Equipamento: geladeira, estantes para tubos, placa de reação ou cartão teste, micropipetas, ponteiras para pipetas e recipiente para descarte.
Teste Qualitativo: Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 40μl na mesma área da amostra. Pipetar 40μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após dois minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparando a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 200 UI/mL. 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. Concentração igual ou superior a 200 UI/mL. A intensidade não é indicativo de concentração; para tanto, realizar o teste semi-quantitativo. 
Teste Semi-Quantitativo: Preparar diluições seriadas do soro (1/2,1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64) utilizando solução salina. Homogeneizar a suspensão de látex e pipetar 40μl na mesma área da amostra. Pipetar 40μl das amostras (soro do paciente, controle positivo e negativo) em uma área do cartão-teste. Misturar bem com o uso de vareta plástica e/ou em movimentos circulares. Após dois minutos, observar (movimentando o cartão) se houve ou não aglutinação, comparado a amostra do paciente com os resultados obtidos com o controle positivo e controle negativo. Será considerado título a maior concentração da amostra que apresentar aglutinação macroscópica. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 200 UI/L. 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. A concentração de PCR será dada pelo seguinte cálculo: Concentração (UI/mL) = 200 X D, onde 200 é a sensibilidade do teste e D, a maior diluição que apresenta aglutinação. EXEMPLO: Se o título obtido for 1:8, a concentração aproximada de PCR existente na amostra será: 200 x 8 = 1600 UI/mL. 
4. CONCLUSÃO
	Os testes laboratoriais imunológicos podem fornecer informações importantes para o diagnóstico e cuidado clínico dos pacientes. Os testes detectam a presença de anticorpos contra parasitas, fungos, bactérias ou vírus. Podem também detectar a presença dos antígenos desses agentes, indicando diretamente a sua presença no hospedeiro. Os testes imunológicos podem ainda ser utilizados para a detecção de hormônios ou outras substâncias químicas. 
	Nossa aula prática foi de suma importância pois vivenciamos na prática como são executados os testes, o passo a passo de cada um minuciosamente e a grandeza de cada técnica e por fim o resultado que para alguns paciente devido a alterações de certa forma não encontra-se dentro do esperado. 
REFERÊNCIAS
BONMANN et al, Tipagem sanguínea abo/rh: discrepancias entre a técnica em tubo e em lâmina. Disponível em https://home.unicruz.edu.br/seminario, acesso em 10/06/2020. 
GIRELLO, Ana; KUHN Telma, Fundamentos de imuno-hematologia eritrocitária. São Paulo: Senac, 2013.
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Tipagem sanguínea – lamina e tubo
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Teste rápido – HCG.
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Teste de aglutinação – VDRL
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Teste de aglutinação – PCR
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Teste de aglutinação – FR.
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA; Teste de aglutinação – AEO (ASO).