RELATÓRIO COLORAÇÃO DE GRAM (1)

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MICROBIOLOGIA
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
ELISA HELENA FRUGOLI 
KAROLINE INÁCIO TEXEIRA
LARISSA MARIA DE MORAES 
LUIS GUSTAVO BENICIO DE MATOS VICENTINO
RAUL PIMENTEL MARQUES 
 
 
 
 
 
 
ITAPIRA/SP
SETEMBRO/2021
SUMÁRIO 
INTRODUÇÃO	3
OBJETIVO	3
METODOLOGIA	7
RESULTADO E DISCUSSÃO	8
CONCLUSÃO	8
REFERÊNCIAS	11
 
 
www.etecitapira.com.br
Av. Paulo Lacerda Quartin Barbosa, 630 – Parque Santa Bárbara – Itapira – SP (19) 3813 4548/ 3843 1171
INTRODUÇÃO
Neste relatório, será descrito a aula prática realizada sobre coloração de Gram, mostrando a técnica, os corantes e os procedimentos necessários.
Hans Christian Joachim Gram (1853-1938) nasceu em Copenhague em1853. Seu pai foi Frederik Terkel Julius Gram, advogado e professor de jurisprudência; sua mãe foi Louise Christiane Roulund. Estudou medicina naUniversidade de Copenhague e obteve o título em 1878. Durante vários anos exerceu a medicina como interno, e depois como médico residente, no Hospital Municipal de Copenhague. Realizou investigações sobre o número e tamanho dos glóbulos vermelhos, que o fizeram merecedor, em 1882, de uma medalha de ouro em sua Universidade. Sua tese de doutorado tratou deste tema. Gram viajou pela Europa durante dois anos, formando-se em farmacologia e bacteriologia (MOREIRA,2015, pág. 29). Estudou em Estrasburgo, Marburgo e Berlim. De regresso a Copenhague, se habilitou e foi ajudante de farmacologia entre 1886 e 1889. Em 1891, alcançou o grau de professor, cargo que desempenhou até 1900. Depois mudou de cátedra para a de patologia e terapêutica. Em 1892, foi nomeado chefe de Medicina interna no Hospital Kongelige Frederiks, posto que manteve até sua aposentadoria em 1923(MOREIRA,2015, pág. 29).
 A figura de Gram é conhecida porque seu nome se converteu em epônimo que ainda hoje é utilizado, ainda que alguns desconheçam a sua origem. Gram estudou as técnicas de coloração das bactérias, trabalho que desenvolveu em Berlim quando trabalhava com Carl Friedländer (1847-1887). Seus trabalhos foram publicados na revista Fortschritte der Medezin. Gram afirmou: “Eu publiquei um método, mas sou consciente de que, todavia, é defeituoso e imperfeito; porém desejo que em mãos de outros investigadores possa resultar útil”. Enquanto analisava 30 Estudos da Pós-Graduação os tecidos dos falecidos por pneumonia, descobriu que algumas bactérias mantinham a coloração e outras não (MOREIRA,2015, pág. 30). Realizou a coloração com violeta de genciana, depois fixou com lugol e em seguida lavou com etanol. Havia bactérias que retinham a cor e apareciam de cor violeta ao microscópio e outras perdiam está cor (por terem sido descoradas). Ele notou que estas bactérias descoradas podiam ser contra coradas com marrom de Bismarck ou vesuviana. Mais tarde Carl Weigert incorporou um novo corante ao processo; adicionou Safranina depois da etapa de lavagem com etanol. Desta maneira as bactérias que não retinham a coloração inicial (violeta) apareciam coradas de vermelho, e foram chamadas de Gram-negativas, frente às que se coravam primitivamente de violeta que eram as Gram-positivas. Gram foi na realidade um grande clínico. Manteve um consultório privado que teve muito êxito e que só parou quando se aposentou em 1923. Recebeu em vida o reconhecimento pessoal de seus colegas e de instituições de vários países. Morreu em Copenhagen em 14 de novembro de 1938 Moreira (2015 pág 30, apud BECK, 2000).
O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constitui peça importante e fundamental na erradicação e no controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST). Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local. Os custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um balcão com pia e um bico de Busen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio com objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratório treinados, responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho.
Como já mencionado a coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas pois retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e aparecem em azul escuro, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas que não são capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração.
Nos métodos de bacterioscopia existem duas técnicas que são empregadas para a visualização de bactérias, sendo elas: a fresco (sem coloração) e fixado e corado.
Através do exame a fresco são observados os microrganismos vivos, e na técnica com coloração os microrganismos são corados após mortos pelas interações químicas (geralmente ocorrem com o auxílio de calor).
Dentre todos os métodos existentes, aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de microbiologia são os métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.
A diferença entre ambas tem relação com a estrutura da parede celular das bactérias. As Gram (+) são formadas por uma espessa camada de peptidoglicano, já a parede celular das Gram (-) são formadas por uma fina camada de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarideo e proteína.
Após a descrição do método de Gram, inúmeras propostas de modificação foram feitas. O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contraindicada. O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (99,5º Gay Lussac). Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica. Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina. A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro. Observe abaixo a representação:
A melhor forma de visualização dos microrganismos ou de suas estruturas só é possível se a preparação estiver adequada.
OBJETIVO 
Nessa pratica tínhamos como objetivo pôr em pratica a técnica coloração de Gram com a utilização do microscópio, vendo na pratica o que foi passado nas aulas teóricas de microbiologia. 
METODOLOGIA
MATERIAIS
· Álcool 70% (C2H5OH)
· Cristal Violeta (C24H28N3Cl)
· Fucsina (C20H20N3)
· Iogurte 
· Lugol (I3K)
· Óleo de imersão 
· Yakult
EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
· Colher 
· Grade 
· 2 Lâminas 
· 2 Lamínulas
· Luvas descartáveis 
· Microscópio óptico 
· Pipeta Pasteur
PROCEDIMENTOS
Para analisar as amostras de iogurte e yakult utilizamos, o microscópio óptico, água destilada(H2O), álcool 70% (C2H5OH), Cristal Violeta (C24H28N3Cl), Fucsina (C20H20N3), Lugol (I3K), Óleo de imersão, 1 colher (para pegar o iogurte), uma pipeta pasteur (para pegar o yakult), duas lâminas de vidro e duas Lamínulas. 
Para conseguirmos analisar melhor o iogurte, e o yakult primeiro foi feito o esfregaço, depois a parte da coloração, utilizado sobre a lâmina de vidro o Cristal violeta por um minuto e colocando ela em espera na grade. Logo após, colocamos o lugol por mais um minuto e novamente na grade. Em sequencia passamos o álcool 70% durante cinco segundos, e para finalizar a coloração utilizamos a fucsina por 15 segundos, logo após foi feita a análise no microscópio.
RESULTADO E DISCUSSÃO
As análises microscópicas da prática de coloração de Gram, para a visualização de bacilos, renderam ao grupo que confeccionou este documento os seguintes resultados:
IOGURTE 
Com o aumento de 40x não foi possível identificar nenhuma colônia de maneira clara, apenas algumas manchas que eram nada mais que as colônias em sua forma mais densas.
 
Já o aumento de 100x, fez com que pudéssemos fazer a identificação das colônias de bactérias, ainda que distantes da lente.
 
Com o aumento em 400x já tivemos uma melhor visualização das colônias.
 
Já com o aumento de 1000x e o auxílio do óleo de imersão, foi possível visualizar as colônias quase que claramente. 
YAKULT
 
No caso do Yakult, tivemos uma maior dificuldade em identificar as colônias, levando em conta que no aumento de 40x não foi possível ver nada com clareza.
 
Com a lente de 100x tivemos um pouco mais de dificuldade para verificar as colônias, tendo em vista que a amostra teve apenas a fucsina fixada.
 
Já no aumento de 400x, por mais que ainda estivessem desfocadas, já era possível a visualização das colônias.
 
Após adicionarmos o óleo de imersão para uma melhor visualização da lente de 1000x, pudemos ver claramente as colônias de bacilos.
CONCLUSÃO
Com essa prática realizada em laboratório, foi possível aprofundar os conhecimentos sobre a técnica de coloração de Gram, colocando em ação tudo que foi visto em sala, durante as aulas de microbiologia.
Nessa aula prática foi analisado com o microscópio óptico a visualização de uma amostra de iogurte e yakulte com seus devidos corantes, que possibilitaram a técnica da coloração de gram.
Como era pouca a quantidade das amostras, foi necessário a utilização da lente de aumento de 1000x para uma melhor vizualição, por conta disso foi utilizado o Óleo de imersão para auxiliar na lente de 1000x.
O intuito da aula era colocar em pratica a técnica da coloração de Gram, com a utilização de um microscópio óptico, para assim, obter esse resultado.
Foi concluído através desse trabalho que podemos fazer a visualização de bactérias gram positivas e gram negativas, que podem ser encontradas em moléculas da lactose, com o uso de um microscópio óptico. Também foi possível ver a morfologia dos mesmos, assim como ver suas moléculas com uma coloração roxa, devido ao cristal violeta, que tem como papel aumentar a visualização dessas moléculas.
REFERÊNCIAS 
BATISTA, Juliana; OLIVEIRA, Matheus; TELES, Rudá. Relatório de Aula Prática: Coloração de GRAM. Ceará, 2019. 7 p. Disponível em: <https://www.academia.edu/38322664/Relat%C3%B3rio_de_Aula_Pr%C3%A1tica_COLORA%C3%87%C3%82O_DE_GRAM>
DE MELLO, Amanda Micheli Mariano; VARELA, Gabriel S. Microbiologia: Coloração GRAM. Campo Grande, 2017. 8 p. Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/44241369/relatorio-microbiologia-coloracao-gram>
PROGRAMA NACIONAL DE DST E AIDS. Técnica de Coloração de GRAM. Brasília, 2001. 66 p. Disponível em: <https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf>