revisão de biologia molecular

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Biologia Molecular 
Revisão 
 
→ OS ÁCIDOS NUCLEICOS 
 
 
→ Extração de DNA 
 
→ Reação de Cadeia pela Polimerase - PCR 
 
 
 
 
 
 
→ Eletroforese em Gel de Agarose 
 
 
→ Real Time - PCR 
Termociclador: com sistema óptico composto por uma 
fonte de iluminação ultra-violeta e um detector de 
fluorescência + um computador com software próprio 
para a aquisição de dados 
 
→ Polimorfismos Genéticos 
Tipos de polimorfismos genéticos: 
→ Polimorfismo de nucleotídeo único (SNPs) 
→ Polimorfismo de inserção e deleção (indels) 
→ Polimorfismos de microssatélites (STR) 
→ Polimorfismos de minissatélites (VNTR) 
→ Polimorfismos de sítios de restrição (RFLP) 
 
Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) 
 Substituição de um ou outro par de bases em 
uma sequência específica do genoma. 
 
Polimorfismos de inserção e deleção (indels) 
 
Polimorfismos de STR (Short Tandem Repeats) – 
microssatélites. 
 Consiste em trechos de DNA repetidos em 
“tandem” em um local específico no genoma. 
 Repetições constituídas de 2 a 9 pares de bases. 
 
Polimorfismos de STR/microssatélites 
 
 
Polimorfismos de VNTR (Variable Number of Tandem 
Repeats) – minissatélites. 
 São sequências que se repetem em “tandem” 
constituídas de 10 a 64 pares de bases. 
 O número de repetições encontradas varia de 
um local para outro dentro do genoma, e 
também varia entre indivíduos. 
 
Polimorfismos de inversão 
 Diferem em tamanho, podendo estar presentes 
em qualquer uma das duas orientações nos 
genomas de indivíduos diferentes. 
 
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 
 Identifica a presença de polimorfismos 
no DNA dos indivíduos de uma 
população, utilizando enzimas de 
restrição 
 São enzimas produzidas por bactérias 
para se defender de vírus 
 Atuam como “tesouras moleculares” 
 
Por que as enzimas de restrição são “tesouras 
moleculares”? 
Elas identificam sequências de pares de bases específicas 
no DNA e cortam o DNA nesses pontos específicos 
 
→ Método de Sanger: 
→ Reagentes do sequenciamento: 
→ DNA molde 
→ Primer 
→ Buffer save money – Mg2+ e Tris- HCl 
→ dNTPs: Desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, 
dTTP) 
→ Enzima Taq polimerase 
→ ddNTPs: Didesoxinucleotídeos (ddATP, ddCTP, 
ddGTP, ddTTP); 
 
Etapas do sequenciamento: 
 Desnaturação: 96°C – 2 minutos 
 Anelamento: 50°C – 15 segundos 
 Extensão: 60°C – 4 minutos 
 
Etapas do sequenciamento: 
 Purificação – remoção dos nucleotídeos não 
incorporados 
 Sequenciador automático – eletroforese capilar 
 Análise do cromatograma (bioinformática) 
 
Piro sequenciamento 
Ação de 4 enzimas diferentes: 
 DNA polimerase 
 ATP sulfurilase 
 Luciferase 
 Apirase 
 Substratos utilizados: 
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS) e Luciferina 
 
1. Enzima Apirase: 
Promove a desfoforilação dos desoxiribonucleosídeos 
trifosfatos (dNTPs) em nucleosídeos monofosfatos 
(dNMPs) 
 
2. Enzima Luciferase: 
Promove uma reação química que emite LUZ!!! 
Luciferina 
 + 
 ATP 
 + 
 O2 
 
 
3. Enzima ATP sulfurilase: 
Transforma adenosina-fosfosulfato (APS) em ATP!!! 
 
4. Enzima DNA polimerase: 
Insere os dNTPs sintetizando a fita de DNA 
complementar a fita molde. 
 
→ CLONAGEM DE DNA 
 
➢ Etapas da clonagem DNA: 
1. Isolar o gene de interesse 
2. Unir o gene ao vetor: DNA recombinante 
3. Transformação 
3.1 Choque térmico 
3.2 Eletroporação (corrente elétrica) 
3.3 Biobalística (canhão gênico) 
 4. Seleção dos clones recombinantes 
 5. Multiplicação ou expressão do gene de interesse 
 
 
. 
 
luciferase 
Oxi-luciferina + CO2 + 
 
 AMP + PPi +