Sequenciamento de DNA

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Biologia Molecular 
Sequenciamento de DNA 
 
→ MÉTODO DE SANGER 
Reagentes do sequenciamento: 
→ DNA molde 
→ Primer 
→ Buffer save money – Mg2+ e Tris- HCl 
→ dNTPs: Desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, 
dTTP) 
→ Enzima Taq polimerase 
→ ddNTPs: Didesoxinucleotídeos (ddATP, ddCTP, 
ddGTP, ddTTP); 
 
Etapas do sequenciamento: 
→ Desnaturação: 96°C – 2 minutos 
→ Anelamento: 50°C – 15 segundos 
→ Extensão: 60°C – 4 minutos 
→ Purificação – remoção dos nucleotídeos não 
incorporados 
→ Sequenciador automático – eletroforese capilar 
→ Análise do cromatograma (bioinformática) 
 
Proposto por Mostafa Ronaghi (1996) 
 Pesquisador na Universidade de Stanford 
 Detecção através de luz 
 Resultados obtidos rapidamente 
 
Ação de 4 enzimas diferentes: 
 DNA polimerase 
 ATP sulfurilase 
 Luciferase 
 Apirase 
 Substratos utilizados: 
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS) e Luciferina 
 
1. Enzima Apirase: 
Promove a desfoforilação dos desoxiribonucleosídeos 
trifosfatos (dNTPs) em nucleosídeos monofosfatos 
(dNMPs) 
 
2. Enzima Luciferase: 
Promove uma reação química que emite LUZ!!! 
3.Enzima ATP sulfurilase: 
Transforma adenosina-fosfosulfato (APS) em ATP!!! 
4. Enzima DNA polimerase: 
Insere os dNTPs sintetizando a fita de DNA 
complementar a fita molde. 
 
Método de sanger de boa qualidade 
 
 
 
Método de sanger de qualidade média 
 
 
Método de sanger de baixa qualidade 
 
 
 
 
 
 
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