Resumo - Técnicas de Diagnósticos Imunológicos (1)

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Técnicas de Diagnósticos Imunológicos
Técnicas de Diagnósticos Sorológicos
São técnicas imunológicas para identificar
antígenos e anticorpos no sangue e se há sua presença.
Há a necessidade da ação conjunta do antígeno e
anticorpo, para caracterizar, detectar e quantificar os
mesmos.
★ Métodos sorológicos
- Reagentes não marcados
Os reagentes não marcados possuem uma
sensibilidade de detecção menor,
necessitando de uma quantidade maior de
complexos de relação antígeno/anticorpo. As
Reações de Precipitação e de Aglutinação
ocorrem, pela ligação entre o Anticorpo e
Agente solúveis ou particulados.
Reação de aglutinação
É o agrupamento de antígenos particulados, como
por exemplo as bactérias ou eritrócitos através da ação
dos anticorpos. Promovendo a fixação dos anticorpos na
superfície das hemácias.
Aglutinação Direta - O antígeno (insolúvel)
é parte da célula, e a aglutinação acontece
pelo anticorpo contra o antígeno.
Aglutinação Indireta ou Passiva - É a adesão
de anticorpos ou antígenos protéicos
(solúveis) na parte externa de
micropartículas inertes.
Reação de precipitação
É o agrupamento de moléculas de antígenos que
possuíam solubilidade através dos anticorpos visando a
produção de precipitados visíveis.
Imunodifusão Radial Simples: Identifica a
quantidade de concentração de anticorpo e
antígeno.
Imunodifusão Dupla: Indica as
características imunológicas do antígeno.
Imunoeletroforese - Faz a comparação de
misturas complexas de agentes que são
separados em gel ágar por corrente elétrica.
- Reagentes marcados
Os reagentes marcados possuem uma sensibilidade de
detecção maior, necessitando de uma quantidade maior de
complexos de relação antígeno/anticorpo.
Radioimunoensaio
É um método de análise que quantifica as reações
do anticorpo e antígeno e detecta a sequência de
nanogramas ou picogramas.
RIA - Radioimunoensaio com antígeno marcados.
IRMA - Imunorradiométrico com anticorpos marcados.
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
São reações antígeno-anticorpo que podem ser
detectadas com reações enzimáticas. As enzimas mais
utilizadas são as peroxidase e fosfatase alcalina, pois
catalisa as reações de desdobramento da água oxigenada
em água junto com oxigênio.
A presença dos antígenos ou anticorpos é
identificada por meio da coloração com a adição de
substrato da enzima junto com uma substância cromógena.
Possui 4 tipos, sendo eles: Direto, Indireto,
Sanduíche e por Competição.
ELISA Direto: O antígeno é ligado a uma
placa e um anticorpo (primário) ligado a uma
enzima é adicionado. Porém devido a
sensibilidade baixa, não é o mais usado.
ELISA Indireto: Semelhante ao Direto, porém
utilizando um anticorpo secundário,
aumentando a especificidade.
ELISA Sanduíche: O anticorpo é ligado a uma
placa e um antígeno se liga a ele. Logo
depois é adicionado outro anticorpo unido a
uma enzima que se liga também ao antígeno.
Teste de sensibilidade alta.
ELISA de Competição: Um antígeno é marcado e
logo em seguida passa a competir com o alvo,
se na amostra possuir mais antígenos não
marcados (do alvo) do que marcados, sua
ligação é menor e sua coloração diminui.
Esse método é mais utilizado quando o alvo é
pequeno ou possui poucos epítopos de
ligação.
Imunofluorescência - Direta e Indireta (IFD e IFI)
Auxilia no diagnóstico de dermatoses
vesicobolhosas autoimune e avaliação de anticorpos
circulantes. Fluorocromos mais utilizados: Fluoresceína
e Rodamina. É dividida em Direta e Indireta.
- Direta: Incubado com anticorpos marcados com
fluoresceína dirigidos a imunoglobulinas humanas
(IgA, IgM, IgG) e a complemento (Geralmente C3).
Locais recomendados para biópsia:
- Região Perilesional: Dermatoses vesicobolhosas
- Na lesão ativa em evolução: Nas colagenoses
- Em lesões recentes: Nas vasculites
- Indireta: Substrato contendo o antígeno, incubado
com o soro do paciente. Após a reação, adiciona o
segundo anticorpo (reação indireta) contra as
imunoglobulinas marcadas. Reação positiva indica
auto-anticorpos.
Western blotting
A técnica de Western Blotting consiste em detectar
e quantificar proteínas específicas nas amostras de
tecido homogenizado.
Ele é dividido em 5 etapas:
1. Extração de proteína
2. Eletroforese em gel
3. Isolação de proteínas usando membranas de
transferência
4. Detecção da proteína alvo por meio de
incubação da membrana com anticorpo.
5. Análise de dados utilizando a membrana
Essa técnica é mais utilizada em:
- Análise de tamanho e quantidade de uma
proteína
- Diagnosticar doenças em humanos/animais
- Detectar proteínas defeituosas
Técnicas de Diagnósticos Moleculares
São técnicas da biologia molecular, para
identificar micro-organismos a partir da análise de
material genético: DNA, RNA ou proteínas.
Não existe a necessidade do isolamento do agente
infeccioso. Podem ser identificados microrganismos em
amostras muito diluídas. Permitem identificar cepas
diferentes em um único nucleotídeo.
★Métodos moleculares
Hibridização in situ Fluorescente (FISH)
Permite descobrir sequências de DNA ou RNA, no
corte do tecido ou células com uso de sequências
complementares de DNA ou RNA em fita única, formando
sondas de DNA e RNA.
Etapas da Hibridização in situ
1. Coleta do material biológico
2. Fixação e desidratação
3. Hibridização
4. Detecção da sonda por imunohistoquímica.
5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina.
Sondas de DNA e RNA
É feita a utilização de amostras de DNA, aplicadas
em eletroforese e transferida para filtro de
nitrocelulose.
Southern blotting: DNA - DNA
- Identifica polimorfismo de DNA ou mutação.
- O DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência.
Northern blotting: RNA - DNA
- Estudo da expressão gênica e padrão temporal de
genes.
- Estuda diferentes tecidos.
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
Reação em cadeia da polimerase é a técnica
que amplifica cópias do DNA, que tem como base o
processo de duplicação do DNA. Tornando a
sequência de DNA grande e disponível para várias
técnicas.
In vitro ela proporciona a duplicação de
cadeias de DNA. Fazendo uma cópia igual ao do DNA
(replicação).
É o método mais utilizado
quando se há pouco material
genético para ser analisado,
então ele é multiplicado na
PCR. O PCR é usado para
identificar microrganismos
infecciosos.
Seu processo é dividido em 3
etapas, sendo elas
respectivamente: Desnaturação,
Anelamento e Extensão.
1. Desnaturação: A amostra é aquecida
para separar as fitas do DNA, deixando
uma fita única, que servirá de molde
para replicação.
2. Anelamento: A amostra é resfriada e os
primers se unem à sequência do molde.
3. Extensão: Eleva a temperatura para a
extensão dos primers, que irão
sintetizar novas fitas de DNA
Variações:
- RT - PC
- RAPD-PC
- Nested PCR
- Multiplex PCR.
- PCR - real time
PCR em tempo real (qPCR)
O PCR em tempo real é conhecido como Real Time. É
uma técnica que pode-se visualizar o processo em tempo
real.
Permite o aumento da imagem e que detecção
aconteçam ao mesmo tempo em um sistema fechado e tem o
sistema de detecção fluorescente.
Consegue determinar a quantidade de DNA e RNA
(depois da conversão do DNA). Na amostra quanto mais DNA
ou RNA presente, as moléculas de DNA serão sintetizadas
mais rápido.
Sequenciamento de DNA
É um processo para a sequência de nucleotídeos de
uma molécula de DNA desconhecido. Nas bactérias
aplica-se o sequenciamento da subunidade ribossomal 16S.
É usado métodos de fluorescência para detectar os
nucleotídeos.
Referências
P.J. Quinn , B.K. Markey , F.C. Leonard , E.S.
Fitzpatrick , S. Fanning.Microbiologia Veterinária
Essencial 2 Ed. Porto Alegre. Artmed, 2019
TIZARD, I.R. Imunologia veterinária 6 ed. São
Paulo: Roca, 2002
http://www.icb.usp.br/bmm/mariojac/arquivos/Aulas/
Aula%20Diagn%C3%B3stico%20molecular
https://pt.slideshare.net/nataliaborges/tcnicas-mo
leculares
https://www1.ibb.unesp.br/Home/Departamentos/Micro
biologiaeImunologia/metodos_sorologicos.pdf
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patol
ogia
https://pt.slideshare.net/Love_Pharmacy/introducao
-a-tecnicas-de-diagnostico-molecular-3https://pt.slideshare.net/labimuno/radioimunoensai
o-3540380
Referências das imagens
Imagens
- Aglutinação direta
- Aglutinação Indireta ou Passiva
- Imunoeletroforese
- Imunofluorescência
- PCR
ROMEU. Interações Ag x Ac - Testes Sorológicos
Secundários, 2013. 23 slides. Disponível em:
<https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/
HELIOJOSEMONTASSIER/aula-6-sorologicos-secundarios-romeu
.pdf>. Acesso em: 09 de jun. de 2021
Imagem
- Western blotting
VIVIANE. Técnicas de Western Blotting, 2015. 21 slides.
Disponível em:
<https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/
HELIOJOSEMONTASSIER/aula-western-blotting.pdf>. Acesso
em: 09 de jun. de 2021
Imagem
- Hibridização
HIBRIDIZAÇÃO dos ácidos nucleicos, 2008. 17 slides.
Disponível em:
<http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Hi
bridacao%20de%20acidos%20nucleicos.pdf>. Acesso em: 09
de jun. de 2021
Imagens
- Imunodifusão radial simples
- Imunodifusão dupla
COSTA, Maria Lucília Machado da. MICROBIOLOGIA E
MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA CLÍNICA IMUNOLOGIA CLÍNICA
Aula 3: DIAGNÓSTICO MOLECULAR E SOROLÓGICO, 2018. 62
slides. Disponível em:
<https://docero.com.br/doc/nx010nv>. Acesso em: 09 de
jun. de 2021
Imagem
- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
MÉTODO Elisa. Hhub, [s. d.]. Disponível em:
<https://www.hhub.com.br/>. Acesso em: 09 de jun. de
2021