Biologia Molecular e Diagnostico de Doencas

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PROF: GERALDO XAVIER
CITOGENÉTICA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações
Perda:
	 deleção
	 monossomia
Ganho: 
	duplicação, amplificação 	trissomia, poliploidia
Relocação: 
	 translocação
	 inversão
	inserção
CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas
Resolução:
~6milhões pb
~50genes/banda
 >4 Mb
CITOGENÉTICA MOLECULAR
Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromos		
Identificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadores
Detecção de alterações cromossômicas em núcleos interfásicos
Estudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)
SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)
M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) 
CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)
Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência
Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)
DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico
ETAPAS
Preparação da lâmina (DNA 		alvo)
Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC
Pré-tratamento:
Ácido acético
RNase e pepsina
Desidratação Etanol
Hibridização sonda/DNA 
(estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)
Lavagem pós-hibridização: 
tampão 2xSSC (citrato de sódio)
Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI
Fluorocromos: Sondas
FITC-fluoresceína (verde)
Espectrum green ( verde)
Rodamina (vermelho)
Texas red (vermelho)
ETAPAS
Material:
-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços 
-cromossomos metafásicos: cultura celular
ETAPAS
Hibridização
(câmera úmida à 37oc)
ETAPAS
Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência
TIPOS DE SONDAS
Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:
	-sonda alfa-satélite (centromérica)
	-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)
	-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)
	-sonda telomérica (telômeros)
Sondas de cópia única ou locus específica
Sondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting
TIPOS DE SONDAS
TIPOS DE SONDAS
SONDAS CENTROMÉRICAS
Enumeração dos cromossomos e aneuploidias
APLICAÇÃO:
aneuploidias em núcleos interfásicos
SONDAS CENTROMÉRICAS
Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)
gastrite:+7
gastrite: -7
úlcera: +8
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Diagnóstico de doenças com microdeleção
Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Mucosa normal:
TP53 (vermelho)
17 (verde)
Adenocarcinoma gástrico:
Deleção TP53
1 sinal vermelho
Deleção do gene TP53 em câncer gástrico
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
SONDAS WCP – Cromossomo Total
Detecção de Translocação recíproca balanceada
SONDAS WCP – Cromossomo Total
 A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), 
B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta). 
SONDAS WCP – Cromossomo Total
SONDAS TELOMÉRICAS
SONDAS TELOMÉRICAS
Aplicação:
-Deleções terminais
 -perdas teloméricas
SONDAS TELOMÉRICAS
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Estrutura e organização dos cromossomos
Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções
Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos
Identificação de alterações cromossômicas em esperma
Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação
Diagnóstico de neoplasias
Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)
Mapeamento de genes e sequências gênicas
FISH 
-
Fluorescent “
in situ
” hybridization
FISH 
-
Hibridização Fluorescente “
in situ
”
Blue
Acqua
Green
Yellow
Orange
Red
Cláudio C. Silva
UCG/LaGene
FISH - Fluorescent “in situ” hybridization
FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”
Cláudio C. Silva
UCG/LaGene
Blue
Acqua
Green
Yellow
Orange
Red
•Método para obtenção de núcleos
interfásicos a partir de tecido fresco
Desagregação dos
núcleos
Fixação dos núcleos
	Método para obtenção de núcleos interfásicos a partir de tecido fresco
Desagregação dos núcleos
Fixação dos núcleos
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento Aplicação da sonda
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento Aplicação da sonda
Co-denaturação Lavagem pós-hibridação
Contra-coloração Análise ao microscópio
Co-denaturação Lavagem pós-hibridação
Contra-coloração Análise ao microscópio