AVALIAÇÃO TAXONÔMICA DE CULTURA MICROBIANA ADAPTADA A EFLUENTE PETROQUÍMICO, APLICADA EM ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA DE ANILINA.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
 
 
 
 
 
GABRIEL VICTOR DE LIMA 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO TAXONÔMICA DE CULTURA MICROBIANA ADAPTADA A 
EFLUENTE PETROQUÍMICO, APLICADA EM ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO 
ANAERÓBIA DE ANILINA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Recife 
2021 
GABRIEL VICTOR DE LIMA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO TAXONÔMICA DE CULTURA MICROBIANA ADAPTADA A 
EFLUENTE PETROQUÍMICO, APLICADA EM ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO 
ANAERÓBIA DE ANILINA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientador: José Roberto Santo de Carvalho 
Coorientadora: Sávia Gavazza dos Santos Pessôa 
 
 
 
 
Recife 
2021 
FICHA CATALOGRÁFICA 
 
GABRIEL VICTOR DE LIMA 
 
 
AVALIAÇÃO TAXONÔMICA DE CULTURA MICROBIANA ADAPTADA A 
EFLUENTE PETROQUÍMICO, APLICADA EM ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO 
ANAERÓBIA DE ANILINA. 
 
 
Trabalho de conclusão de curso 
apresentado à coordenação do curso de 
Bacharelado em Ciências Biológicas da 
Universidade Federal de Pernambuco, 
como requisito parcial à obtenção do grau 
de Bacharel em Ciências Biológicas. 
 
Aprovada em: 05/04/2021 
Nota: 10 
 
 
 
COMISSÃO EXAMINADORA 
 
___________________________________________ 
Dr. José Roberto Santo de Carvalho (Orientador) 
 Universidade Federal de Pernambuco 
 
___________________________________________ 
Dr. Fernanda Magalhães Amaral 
Universidade Federal de Pernambuco 
 
__________________________________________ 
Prof. Dr. Norma Buarque de Gusmão 
Universidade Federal de Pernambuco 
 
 
 Dedico esse trabalho a minha mãe, que sempre acreditou em meu potencial e 
sempre me incentivou a estudar. 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 Eu sou infinitamente grato a minha mãe, Eliane Cristina da Silva. Sem o apoio, 
carinho e incentivo dela eu jamais teria conseguido ingressar em um curso de 
graduação, foi ela que me ensinou a ser uma pessoa com ética e a amar ao próximo. 
Sou extremamente grato à professora Sávia Gavazza, que desde o meu ingresso na 
universidade sempre acreditou no meu potencial como pessoa e profissional, mesmo 
quando eu mesmo não acreditei. Foi com Sávia que eu aprendi o que é ser um 
profissional extremamente competente sem deixar o lado humano de lado, foi com ela 
que eu aprendi a sempre dar meu melhor, e que ciência não se faz sozinho. Agradeço 
ao meu tutor científico José Roberto, que desde 2018 me ensinou boa parte dos 
conhecimentos necessários para que eu pudesse construir o presente trabalho, foi 
com ele que eu construí o meu pensamento científico. Sou grato a meu companheiro 
Giovanni Costa, pelo amor e apoio emocional que ele sempre me ofereceu. Agradeço 
as minhas companheiras de laboratório, Fernanda Magalhães, Isabelle Câmara e 
Danúbia Freitas, por toda a assistência profissional e companheirismo por elas 
oferecido. Agradeço ao laboratório de saneamento ambiental, por me proporcionar a 
estrutura e os meios para que eu pudesse aprender e praticar ciência. E gostaria de 
finalizar agradecendo ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 
Tecnológico (CNPq), por me oferecer fomento, através de bolsas de iniciação 
cientifica, que me ajudaram a permanecer no curso de graduação. 
 
 
RESUMO 
 
A anilina é uma amina aromática considerada um importante contaminante emergente 
pela sua abundância no mercado global, podendo ser formada na degradação e 
produção de diversos produtos industriais, como pesticidas, fármacos e corantes. Esta 
amina aromática apresenta característica tóxica, mutagênica e carcinogênica com 
efeitos comprovados em vegetais e animais, representando uma ameaça aos 
ecossistemas e a saúde pública. A anilina pode estar presente em ambientes com 
baixa disponibilidade de oxigênio como mananciais eutrofizados, no solo ou em águas 
subterrâneas, através do descarte de efluente não tratado, ou por derramamentos 
acidentais nos processos de transporte e armazenamento de produtos industriais. 
Uma alternativa para a descontaminação desses ambientes que contém anilina é a 
biodegradação, no entanto, poucos artigos tiveram sucesso na biodegradação 
anaeróbia deste composto e muito menos elucidar rotas metabólicas envolvidas na 
biodegradação da anilina, ou os principais táxons responsáveis. No intuito de 
contribuir na solução desse problema esse trabalho avaliou a mudança na estrutura 
taxonômica, de uma cultura microbiana proveniente do tratamento de efluente 
petroquímico, após ser submetida a um ensaio de degradação anaeróbia da anilina. 
Os resultados do ensaio de biodegradação demonstraram que a cultura foi capaz de 
degradar quatro alimentações de 2,8 mg/L de anilina, em um período de 388 dias. 
Durante o ensaio de biodegradação foi detectada a formação de ácido benzoico entre 
0,2 e 1,8 mg/L e não foi detectada nenhuma formação de catecol, indicando que a 
biodegradação da anilina ocorreu em ambiente anaeróbio estrito, por via de 
carboxilação e desaminação da molécula da anilina. A partir dos resultados do 
sequenciamento da região 16S do rDNA, foi possível inferir que a degradação 
anaeróbia da anilina foi realizada por uma relação sintrófica metanogênica entre os 
gêneros Syntrophus, Methanosaeta, Methanobacterium e Petrimonas. 
 
Palavras-chave: Composto aromático. Biodegradação anaeróbia. Efluente 
petroquímico. sequenciamento 16S rDNA. 
 
ABSTRACT 
 
Aniline is an aromatic amine considered as an important emerging contaminant, as it 
is formed in the degradation and production of various industrial products, such as 
pesticides, drugs and dyes. This aromatic amine has a toxic, mutagenic and 
carcinogenic characteristic in plants and animals, representing a threat to ecosystems 
and public health. Aniline can be present in environments with low oxygen availability, 
such as eutrophic springs, in the soil or in groundwater, through the disposal of 
untreated effluent, or through accidental spills in the transport and storage of industrial 
products. An alternative for the decontamination of these environments that contains 
aniline is biodegradation, however few articles elucidate the metabolic routes involved 
in the biodegradation of aniline, or the main responsible taxa. In order to remedy this 
problem, this work evaluated the change in the taxonomic structure of a microbial 
culture from the treatment of petrochemical effluent, after being subjected to an aniline 
degradation test. The results of the biodegradation test demonstrated that the culture 
was able to degrade four feeds of 2.8 mg/L of aniline, in a period of 388 days. During 
the biodegradation test, the formation of benzoic acid between 0.2 and 1.8 mg/L was 
detected and no catechol formation was detected, which demonstrates that the aniline 
biodegradation occurred in a strict anaerobic environment, via carboxylation. and 
deaminating the aniline molecule. From the results of the sequencing of the 16S region 
of the rDNA, it was possible to infer that the anaerobic degradation of aniline was 
accomplished by a methanogenic syntrophic relationship between the genera 
Syntrophus, Methanosaeta, Methanobacterium and Petrimonas. 
 
 
Keywords: Aromatic compound. Anaerobic biodegradation. Petrochemical effluent. 
16S rDNA sequencing. 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10 
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 12 
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................. 12 
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ..................................................................................................... 12 
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................. 13 
3.1 ANILINA ...............................................................................................................................13 
3.1 BIORREMEDIAÇÃO .............................................................................................................. 14 
3.3 BIODEGRADAÇÃO DA ANILINA ............................................................................................ 15 
4 METODOLOGIA .................................................................................................... 19 
4.1 ESCOLHA DO INÓCULO........................................................................................................ 19 
4.2 INOCULAÇÃO DOS MICROCOSMOS .................................................................................... 19 
4.3 TESTE DE BIODEGRADAÇÃO ................................................................................................ 21 
4.5 ANÁLISES TAXONÔMICAS ................................................................................................... 23 
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 24 
5.1 TESTE DE BIODEGRADAÇÃO ................................................................................................ 24 
5.2 DIVERSIDADE ...................................................................................................................... 26 
5.3 TAXONOMIA ....................................................................................................................... 27 
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 32 
REFERÊNCIAS......................................................................................................... 33 
 
 
 
 
10 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
As indústrias relacionadas à produção e venda de corantes movimentam 
mundialmente bilhões de dólares por ano. No final de 2019 a Dainippon Ink and 
Chemicals, Incorporated (DIC Corp.), sediada em Tóquio, investiu cerca de 1,1bilhões 
de dólares na aquisição de indústrias de produção de pigmentos. Estes pigmentos 
são potencialmente aplicados na produção de uma variedade de produtos, como 
automóveis, maquiagem, eletrônicos e principalmente na indústria têxtil (ADAMS, 
2019). 
O Brasil possui a maior cadeia de indústrias têxteis ocidental, representando o 
segundo maior gerador de empregos da indústria de transformações no país. Em 2019 
o setor produziu em média 2,04 milhões de toneladas de tecido, e o faturamento 
cresceu cerca de 4,9%, fechando em R$185,7 bilhões (ABIT, 2020). No entanto, com 
o aumento da produção, respectivamente aumenta-se quantidade de insumos e a 
geração de resíduos decorrentes do processamento desses produtos. Dentre esses 
insumos os corantes ganham destaque, principalmente no segmento têxtil. 
Na indústria têxtil a maior parte dos corantes utilizados são do tipo azo, esses 
corantes são tóxicos e apresentam uma ou mais ligações duplas entre moléculas de 
nitrogênio, tornando o corante mais estável e difícil de ser degradado . Apesar das 
características tóxicas dos corantes azo, vários trabalhos relatam a capacidade de 
consórcios microbianos de reduzir os corantes azo através de enzimas redutases que 
atuam diretamente nas ligações azo, transformando-os em aminas aromáticas, que 
assim como os corantes apresentam características tóxicas e carcinogênicas apesar 
de não apresentarem cor (PARSHETTI et al., 2010). 
A anilina é uma amina aromática, composta por um anel benzênico ligado a um 
grupo amino, bastante utilizada na síntese de produtos como os próprios corantes da 
indústria têxtil, ou mesmo, na produção do Metileno Difenil Diisocianato (MDI), 
componente principal para a produção do poliuretano. Muitos trabalhos atribuem um 
efeito tóxico, carcinogênico e recalcitrante à anilina, destacando sua capacidade de 
inibição da fotossíntese e respiração em ambientes aquáticos, podendo também 
causar efeitos tóxicos ao baço, sistema nervoso e endócrino humano (MAKHDOUMI 
et al., 2019). Dessa forma, o lançamento indevido da anilina no meio ambiente 
representa uma ameaça à diferentes ecossistemas e à saúde pública. 
11 
 
Algumas abordagens de tratamento mostraram-se capazes de oxidar a anilina 
através da ozonização (TEKLE-RÖTTERING et al., 2016) ou com a utilização de 
catálise fotoquímica (TANG et al., 2010). Entretanto, esses tratamentos apresentam 
um elevado custo energético e um nível operacional avançado, necessitando de mão 
de obra especializada para monitorar o processo. Uma estratégia mais ecoamigável 
e de menor custo de operação para o tratamento de efluentes contendo anilina é a 
biodegradação. 
Muitos trabalhos relatam a capacidade de culturas microbianas aeróbias mistas 
ou puras em degradar de forma eficiente a anilina. O gênero Acinetobacter é capaz 
de metabolizar anilina convertendo-a a catecol, molécula mais simples que 
posteriormente consegue ser transformada em energia para os microrganismos 
(WYNDHAM, 1986). Uma espécie do gênero Pseudomonas também foi registrada 
como sendo capaz de utilizar a anilina como fonte de carbono e nitrogênio (JIANG et 
al., 2016). Culturas mistas também foram apontadas como sendo capazes de 
consumir a anilina em concentrações de 1500 mg/L (CUI et al., 2017), demonstrando 
o grande potencial de biorremediação da anilina em sistemas aeróbios de tratamento. 
Compostos aromáticos, como a anilina, podem se acumular em ambientes 
pobres em oxigênio como por exemplo no solo e em águas subterrâneas, através da 
degradação de pesticidas e herbicidas, ou por derramamentos acidentais no 
transporte e armazenamento dessas substâncias. Schnell et al. (1989) foi o primeiro 
trabalho a relatar a degradação anaeróbia da anilina, desde então poucos trabalhos 
têm elucidado os mecanismos pelos quais a anilina pode ser degradada 
anaerobiamente, ou quais os principais táxons envolvidos nesses processos. 
Tendo em vista a importância de que a taxonomia microbiana tem para os 
processos de biorremediação e para o tratamento de efluentes industriais, esse 
trabalho tem o objetivo de avaliar as mudanças na composição taxonômica de um 
inóculo previamente adaptado em efluente petroquímico, aplicando-o em ensaios de 
biodegradação da anilina. Os dados obtidos durante o desenvolvimento desta 
pesquisa foram direcionados a avaliar estratégias de biodegradação da anilina, além 
de explorar a comunidade microbiana envolvida no processo. 
 
 
12 
 
2 OBJETIVOS 
2.1 OBJETIVO GERAL 
 
Avaliar as mudanças na composição taxonômica de um inóculo previamente 
adaptado em efluente petroquímico, submetido à ensaios de biodegradação 
anaeróbia da anilina. 
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 
 
a) Avaliar da capacidade do inóculo proveniente de tratamento de efluente 
petroquímico em degradar anilina. 
b) Caracterizar taxonomicamente a comunidade microbiana no inóculo utilizando 
sequenciamento 16S do rDNA. 
c) Avaliar as mudanças na composição taxonômica após a exposição da cultura 
microbiana à anilina durante o ensaio de biodegradação. 
d) Inferir os possíveis metabolismos e táxons envolvidos no processo de 
degradação da anilina. 
 
 
13 
 
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
3.1 ANILINA 
 
Os compostos aromáticos são moléculas que apresentam elevada estabilidade 
em função da nuvem de elétrons (π), conforme demonstrada na Figura 1. Esta é uma 
das principais características que desafiam a sua biodegradação. 
 
Figura 1. Estrutura química do composto aromático benzeno, com destaque para a nuvem de 
elétrons formada, causando a estabilidade da molécula. 
 
Fonte: Solomons e Fryhle (2005). 
 
A anilina é um composto químico altamente versátil, sendo amplamente utilizada 
industrialmente como precursor na síntese de uma variedade de químicos 
intermediários, como 2-metoxianilina e 4-metoxianilina (DURRENS et al., 1981). Tanto 
a anilina como seus derivados são utilizados para produção de corantes têxteis, 
fármacos, pesticidas, herbicidas entre outros produtos. 
A produção comercial da anilinaé realizada através de dois processos. 
Primeiramente ocorre a nitratação do anel de benzeno, formando um nitrobenzeno, e 
em seguida ocorre um processo de hidrogenação para a formação da anilina 
comercial (Figura 2). A anilina, tem sua maior relevância como insumo base para a 
síntese do Metileno Difenil Diisocianato (MDI), utilizado para a produção de espuma 
de poliuretano, que por sua vez é insumo das indústrias automobilísticas mobiliária e 
construção civil (GAMA; FERREIRA; BARROS-TIMMONS, 2018). 
 
 
 
 
 
14 
 
Figura 2: Esquema do processo de fabricação da anilina através da nitratação do benzeno, 
seguida da hidrogenação do nitrobenzeno. 
 
Fonte: CÂMARA (2021) 
 
A anilina, bem como seus derivados e intermediários são representantes de uma 
importante classe de contaminantes emergentes, por estarem presentes nos resíduos 
de uma grande variedade de segmentos industriais e apresentarem características 
tóxicas (SUN et al., 2015). A anilina tem o potencial de afetar anatomicamente e 
fisiologicamente as membranas biológicas, através da formação de radicais livres 
(MOHAMMED et al., 2020). Em animais, a anilina pode ser convertida em 
fenilidroxilamina, que tem capacidade de causar danos ao sistema nervoso e 
cardiovascular (DE FIGUEIREDO et al., 2012). 
Os dois maiores casos de contaminação ambiental por anilina ocorreram na 
china. O primeiro acidente aconteceu em 2012 quando 39 toneladas de resíduo 
contendo anilina foram despejadas no rio Zhuozhang, causando uma crise hídrica nas 
cidades próximas do curso do rio (CHINADAILY, 2013a). E o segundo ocorreu em 
2013 quando um vazamento de anilina no abastecimento de água vila na província de 
Hebei, foi responsável pela morte de 700 frangos (CHINADAILY, 2013b). 
 
3.1 BIORREMEDIAÇÃO 
 
A corrosão acidental de tanques de armazenamento e o lançamento indevido de 
resíduos não tratados são as principais formas de contaminação em solos e águas 
subterrâneas, por contaminantes orgânicos industriais (SUN et al., 2015). Essas 
fontes de contaminação impactam os ecossistemas do solo e das águas subterrâneas, 
causando muitas vezes o consumo do oxigênio presente nesses ambientes, além de 
afetar a fauna e a flora devido a toxicidade inerente das moléculas. Esse problema 
15 
 
ambiental pode ser transferido dentro da cadeia trófica e chegar ao estágio de 
problemas de saúde pública subjacentes (BAUDROT et al., 2018). 
Esses sítios contaminados podem ser tratados com a utilização de técnicas 
físicas, químicas ou biológicas, podendo ser aplicadas de formas isoladas ou 
combinadas. As técnicas físico-químicas costumam apresentar um elevado custo de 
aplicação, no transporte e processamento do material contaminado ou demanda a 
aplicação de outros reagentes (redutores, oxidantes, ar, alcalinizantes etc.) que 
podem ser danosos ao ambiente ou gerar subprodutos também recalcitrantes. 
A partir deste contexto, as técnicas de biorremediação apresentam grande 
vantagem, com relação ao baixo custo de aplicação, se comparados com as 
alternativas físico-químicas, além de promover em muitos casos a mineralização 
completa do composto orgânico de interesse. 
Dentro da biorremediação existem duas grandes técnicas de tratamento, a 
bioaumentação e a bioestimulação. Com relação à bioaumentação cepas ou vetores 
genéticos que apresentam a capacidade de degradação de um contaminante alvo são 
introduzidos em um sítio contaminado. O princípio desta técnica é de que a microbiota 
exógena pode otimizar a capacidade da microbiota nativa, de realizar a biodegradação 
do composto alvo, através de um maior repertório de reações bioquímicas promovida 
pelo aumento da diversidade genética (LENDVAY; LO, 2003). Já a bioestimulação 
visa estimular a microbiota nativa de um local contaminado através da adição de 
nutrientes ou correção de algum fator limitante, para que a degradação ocorra in situ, 
porém esse método necessita que a microbiota nativa apresente capacidade de 
degradação (ABDULSALAM et al., 2011). 
3.3 BIODEGRADAÇÃO DA ANILINA 
 
A biologia molecular tem promovido muitas ferramentas moleculares para a 
identificação, monitoramento e quantificação microbiana (MUYZER; SMALLA, 1998). 
A utilização do sequenciamento da região 16s do DNA ribossomal, para identificação 
taxonômica de microrganismos, permitiu que a ecologia microbiana pudesse entender 
o comportamento de comunidades microbianas em um determinado ambiente. 
A biodegradação da anilina, por diferentes cepas microbianas já foi 
documentada em diversos trabalhos (CUI et al., 2017; WANG et al., 2011; 
WYNDHAM, 1986). A maior parte dos trabalhos desenvolvidos nesta área utilizam o 
16 
 
metabolismo aeróbio, para a mineralização da anilina, seguindo comumente para a 
rota de formação do catecol, que finaliza o processo de degradação seguindo pelo 
ciclo do ácido tricarboxilico, a estratégia microbiana mais comuns (CUI et al., 2017). 
No metabolismo aeróbio a primeira etapa de degradação da anilina em geral 
ocorre, de forma extracelular, pela ação de enzimas monoxigenases ou dioxigenases, 
que incorporam O2 ao anel aromático na forma de radicais hidroxila formando catecol 
e liberando íon amônio. As monoxigenases atuam na rota de meta clivagem do 
catecol, formando o semialdeído-2-hidroxi-muconato como intermediário; já as 
dioxigenases atuam na rota de orto-clivagem, formando o ácido cis-cis-mucônico 
como intermediário (AGHAPOUR; MOUSSAVI; YAGHMAEIAN, 2013). Esses 
intermediários são formados mediante a migração do catecol derivado da anilina 
degradada para dentro da célula, através do transporte transmembrana. Uma vez 
dentro da célula, sofre a ação das oxigenases no citoplasma, que rompem o anel 
aromático, facilitando sua metabolização através do ciclo ácido tricarboxilico 
convertendo os metabolitos finais em fonte energética para a célula (HUANG et al., 
2018a). 
 
Figura 3: Esquema da degradação da anilina, mediante rota de orto-clivagem do catecol, formando 
ácido cis-cis-mucônico como intermediário, intracelularmente. 
 
Fonte:(MOHAMMED et al., 2020). 
17 
 
As culturas aeróbias degradadoras de anilina têm uma grande importância nos 
tratamentos de efluentes industriais que possuem sistema de aeração. Em 
contrapartida, para a utilização em técnicas de biorremediação como a 
bioaumentação em solos, águas subterrâneas, e mananciais eutrofizados onde o 
oxigênio é insuficiente para manter as reações metabólicas aeróbias, essas cepas não 
se desenvolvem, prejudicando a eficiência de remoção do composto alvo. 
Poucos trabalhos relatam a degradação anaeróbia da anilina, por ser 
energeticamente menos favorável quando comparada com a degradação aeróbia, 
consequentemente levando mais tempo para ocorrer. Outra dificuldade é encontrar 
cepas que tenham a capacidade de tolerar a toxicidade da anilina, e que apresentem 
enzimas que facilitem a clivagem do anel aromático, seja pela adição de radicais, 
como atuam as oxigenases produzidas das cepas aeróbias, ou seja por outros tipos 
de mecanismos que diminuam a ressonância do anel aromático induzindo a sua 
abertura (ANLI DINO et al., 2019; HUANG et al., 2018b). 
O primeiro trabalho relevante que documentou detalhadamente a biodegradação 
anaeróbia da anilina foi o de Schnell e Schink (1991). Este estudo utilizou uma cultura 
pura da espécie Desulfobacterium anilini que apresentou a capacidade de mineralizar 
concentrações de 0,46 mM (42 mg/L) de anilina em períodos de 5 a 15 dias sob 
condições anaeróbias. 
Na rota proposta por Schnell e Schink (1991), a anilina sofreria carboxilação 
resultando na formação de 4-aminobenzoato, que foi crescentemente detectado à 
medida que a concentração de anilina diminuía. Posteriormente, ocorria a formação 
de 4-aminobenzoil-CoA, através da ação de uma molécula de CoASH na presença de 
ATP. Por fim, a molécula de 4-aminobenzoil-CoA sofria desaminação formando o 
benzoil-CoA quepor sua vez seguia para as rotas de degradação convencionais bem 
estabelecidas na literatura. 
Após o trabalho de Schnell e Schink, poucos autores relataram a capacidade de 
culturas mistas de degradarem anilina aerobiamente. No entanto as rotas de 
degradação anaeróbia da anilina em culturas mistas permanecem não esclarecidas, 
assim como seus efeitos na composição taxonômica de culturas mistas. Portanto, são 
necessários mais estudos com intuito de explorar a composição taxonômica de 
culturas microbianas que promovam a biodegradação da anilina. Ao estudar tais 
culturas microbianas é de grande relevância entender quais os principais metabolitos 
formados, como também identificar os processos de conversão e biotransformação 
18 
 
dos intermediários que vão formar a rota de degradação do composto. Portanto, o 
presente trabalho teve o intuito de investigar as mudanças taxonômicas ocasionadas 
a uma microbiota previamente adaptada ao tratamento anaeróbio de efluente 
petroquímico, quando exposta a um teste de biodegradação anaeróbio da anilina. 
 
 
 
 
19 
 
4 METODOLOGIA 
 
4.1 ESCOLHA DO INÓCULO 
 
O inóculo utilizado nessa pesquisa foi coletado de um reator biológico do tipo 
UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket) utilizado para tratar efluente de uma 
indústria petroquímica. O ambiente promovido pela composição do efluente 
petroquímico, está geralmente associado à presença de compostos aromáticos 
monocíclicos conhecidos como BTEX (benzeno, tolueno, etil-benzeno e xileno). Esses 
compostos apresentam estrutura molecular muito semelhante a anilina, o que justifica 
o uso dessa cultura nos testes de biodegradação realizados neste trabalho. Os 
metabolismos dessa cultura adaptada aos BTEX podem apresentar capacidade 
enzimática úteis para a degradação biológica da anilina. 
 
4.2 INOCULAÇÃO DOS MICROCOSMOS 
 
O ensaio de biodegradação da anilina foi conduzido em pequenos reatores 
(microcosmos) montados em triplicata, que operaram em condições anaeróbias 
durante todo o experimento. Os microcosmos são compostos por um frasco de vidro 
de penicilina, com volume total de 120 ml, particionado em volume útil de 90 ml 
(preenchido com uma solução de nutrientes e a biomassa utilizada na inoculação) e 
um headspace de 30 ml (preenchido com uma mistura gasosa de 20% CO2 e 80 % 
N2) (Figura 4). 
 
Figura 4: Esquema representativo dos frascos de microcosmos utilizados no experimento. 
Fonte: Autor (2021) 
20 
 
Para o volume útil foi utilizado um meio basal quimicamente definido, com as 
seguintes concentrações nutricionais de macronutrientes e micronutrientes (Tabela 1). 
Essas concentrações foram adaptadas do trabalho de EDWARDS; GRBIC-GALIC, 
(1994) recomendadas para o acondicionamento de culturas microbianas anaeróbias 
mistas. Foi utilizada uma concentração de 0,66 de Resazurina para a indicação do 
potencial redox, com a finalidade de monitorar a anaerobiose do meio. 
 
Tabela 1: Concentrações de macro e micronutrientes na solução final do efluente sintético. 
Compostos 
Concentração 
(mg/L) 
KH2PO4 140 
K2HPO4 286 
NH4Cl 357 
CaCl2.6H2O 32 
FeCl3.6H2O 16 
H3BO3 0,4 
ZnCl 0,13 
Na2MoO4.4H2O 0,13 
NiCl2.6H2O 0,99 
MnCL2.4H2O 1,33 
CuCl2.4H2O 0,13 
CoCl2.6H2O 1,99 
Na2SeO3 0,03 
Al2(SO4)3.18H2O 0,13 
MgSO4.7H2O 8,3 
Resazurina 0,66 
NaHCO3 1333,25 
Fonte: adaptado de Carvalho et al. (2020) EDWARDS; GRBIC-GALIC (1994). 
 
As culturas foram inoculadas em uma quantidade necessária para atingir uma 
concentração de sólidos suspensos voláteis (SSV) correspondente a 0,8 mg/L. Foi 
utilizada anilina (CAS# 62-53-3; fórmula molecular: C6H5NH2; peso molecular: 93,13 
g.mol-1; pico de máxima absorção da luz em 230 nm) cujo padrão foi adquirido da 
Sigma Aldrich (St. Louis, EUA), com pureza de 99,5%, para alimentar os reatores 
numa concentração de 2,8 mg/L de anilina. 
Após a inoculação, os microcosmos foram fechados com uma tampa de butila, 
e selados com lacres de alumínio. Foi realizada uma purga no headspace, com o 
21 
 
auxílio de duas agulhas, por uma delas foi injetada uma mistura dos gases CO2 e N2 
(20:80%) sendo posteriormente expulso através da segunda agulha, durante 5 
minutos. Essa etapa foi realizada para garantir a remoção do O2 contido no espaço 
interno dos microcosmos. Após a purga, os microcosmos foram transportados para 
uma câmara anaeróbia (Glove-box 818GB, Plaslabs®) preenchida com a mesma 
mistura de gases. 
Dessa forma, para o teste do potencial de biodegradação da cultura proveniente de 
efluente petroquímico (CEP), os microcosmos foram formulados conforme a Figura 4 
e foram mantidos na câmara anaeróbia (Figura 5), durante um período experimental 
de 388 dias. 
 
Figura 5: Foto da glove box utilizada no experimento .
 
Fonte: Autor (2021) 
 
4.3 TESTE DE BIODEGRADAÇÃO 
 
Além dos microcosmos contendo o inóculo, também foi adicionado ao teste de 
biodegradação da anilina, um controle abiótico contendo o inóculo autoclavado. Este 
controle, estéril, foi adicionado para poder avaliar se a remoção da anilina teria sido 
realizada pelos microrganismos testados, ou se haveria alguma contribuição 
proveniente da adsorção ou de reações químicas, provenientes de compostos 
presentes no inóculo. 
22 
 
Após a montagem e o acondicionamento dos microcosmos na câmara 
anaeróbia, foi realizada uma primeira coleta de 0,5 ml de cada um deles com o auxílio 
de uma seringa com agulha tipo Quinkle 29G (10 cm) que foi inserida através da tampa 
de butila. As amostras foram filtradas e armazenadas em vials de 2 mL e transportadas 
para fora da câmara para análise. E as concentrações de anilina foram monitoradas 
semanalmente, após a montagem nos microcosmos. 
A concentração de anilina foi determinada com um cromatógrafo líquido de alta 
eficiência (HPLC SHIMADZU LC-20AT), com uma coluna de fase reversa 
(LiChospher® 100 RP-18 (5µm)). A fase móvel utilizada foi composta de 40% de 
acetonitrila e 60% de água Milli Q, com um volume de injeção estabelecido em 50µL. 
O pico de detecção da anilina foi medido no comprimento de onda de 230 nm, com 
tempo de retenção de 5,4 minutos. 
 
4.4 EXTRAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DO DNA 
 
Foram coletadas duas amostras de biomassa para extração de DNA, a primeira 
delas foi coletada do inóculo bruto antes de ser introduzido nos microcosmos contendo 
anilina. A segunda amostra foi retirada ao fim do experimento de biodegradação, 
caracterizando a biomassa que se desenvolveu nos microcosmos. Para extração do 
DNA foi utilizado o kit de extração Kit PowerSoil® (Mo Bio Laboratories Inc. Carlsbad, 
CA), seguindo as instruções do fabricante. Ao final do experimento um dos 
microcosmos da triplicata foi sacrificado para realizar a coleta de biomassa utilizada 
na extração de DNA. O volume de amostra de biomassa coletado no microcosmo foi 
correspondente à 0,5 g. 
Após extração, foi verificada a concentração do DNA purificado utilizando um 
espectrofotômetro (NanoDrop 2000 - Thermofischer®), nos comprimentos de onda 
260 nm e 280 nm, que indicam a pureza do DNA. Todas as amostras de DNA 
apresentaram concentração acima 12 ng/μL, posteriormente enviadas para 
sequenciamento em plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS). 
A plataforma escolhida foi a Illumina Miseq, utilizando o método de análise 
metabarcoding, que permitiu acessar as informações genéticas da região 16S do DNA 
extraído. As condições de sequenciamento foram estabelecidas para 50 mil reads, 
com 300 pares de base cada. O par de primer utilizado foi o 341F-806R, que apresenta 
uma vasta cobertura taxonômica para bactérias e arqueias (TAKAHASHI et al., 2014). 
23 
 
O serviço de sequenciamento foi prestado pela empresa Neoprospecta Microbiome 
Tecnologies (Florianópolis – SC, Brasil), seguindo protocolo descrito por (CHRISTOFF 
et al., 2017). Todas as sequências serão depositadas em um banco de dados públicos 
e terá o código de acesso divulgadonas futuras publicações deste trabalho. 
 
4.5 ANÁLISES TAXONÔMICAS 
 
Após o experimento de biodegradação da anilina, foram realizados teste de alfa 
diversidade, a fim de comparar as mudanças taxonômicas, sofridas pela comunidade 
microbiana presente no inóculo. O cálculo da alfa diversidade permitiu a comparação 
da diversidade da comunidade entre o inóculo (CPI) e a microbiota adaptada a anilina 
(CPF), os índices escolhidos para essa finalidade foram o índice de Simpson (1-D) e 
Shannon (H). 
 
 
24 
 
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO 
5.1 TESTE DE BIODEGRADAÇÃO 
 
Os resultados obtidos no teste de biodegradação de anilina indicaram que a 
cultura petroquímica (CP) foi capaz de remover anilina, em diferentes intervalos de 
tempo para cada alimentação. A triplicata de microcosmos foi monitorada durante um 
período de 388 dias, durante esse intervalo de tempo, foi possível observar o perfil de 
remoção de quatro realimentações na triplicata CP. 
Ao avaliar a variação da concentração de anilina, durante a primeira alimentação, 
observa-se uma rápida diminuição na concentração até o dia 8 de experimento, de 
2,8 mg/L para 1,23 mg/L. Após o dia 8, foi registrado um aumento na concentração 
de anilina de 1,23 mg/L para 2,65 concentração registrada no dia 79 do 
monitoramento. Esse comportamento pode ser atribuído a um fenômeno não biológico 
como a adsorção, neste caso a anilina poderia interagir físico-quimicamente com a 
biomassa ou com moléculas provenientes do inóculo, através de afinidade 
eletroquímica, por exemplo, sendo temporariamente imobilizada (KEYHANIAN; 
FARMANZADEH, 2019). Após a anilina ter sido adsorvida no primeiro instante, a 
mesma voltou a ser liberada aos poucos no meio líquido, justificando o aumento 
ocorrido entre o dia 8 e o dia 79. Quando se observa o controle estéril (CE) é possível 
verificar um comportamento de remoção por adsorção representando uma remoção 
de 12,6% da concentração inicial de anilina, após essa adsorção a concentração de 
anilina se mantem estável por cerca de 230 dias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
Figura 6. Concentração da anilina durante o experimento de biodegração. 
 
Fonte: Autor (2021). As sentas vermelhas indicam as injeções de anilina, e seus respectivos 
dias. 
 
A remoção da primeira injeção de anilina foi registrada no dia 106, do teste de 
degradação em CP. Posteriormente foram realizadas mais três injeções das 
concentrações de anilina (nos dias 111, 147, e 333). Os intervalos de remoção da 
anilina obtidos no teste de biodegradação utilizando a CP, foram respectivamente 27, 
35, 61 e 55 dias, para a primeira, segunda, terceira e quarta injeção. Um detalhe 
importante observado nas curvas de degradação apresentadas na Figura 6 é que a 
cada injeção o intervalo de tempo necessário para degradação foi aumentando, e a 
concavidade da curva de degradação na terceira injeção diferiu das demais. Alguns 
autores relacionam a concavidade da curva de consumo de substrato, tanto com a 
cinética da reação (aumento ou taxa de consumo), quanto com a adaptação 
microbiana, geralmente curvas com concavidade voltada para baixo indicam que está 
havendo um aumento na taxa de degradação ao longo do tempo, o que geralmente 
está associado a um período de adaptação microbiana. Por se tratar de um inóculo 
que veio de reator biológico contendo uma diversificada fonte de contaminantes, é 
provável que a remoção das duas primeiras alimentações de anilina tenha sido 
influenciada pela presença de outros compostos endógenos do lodo. Uma vez 
cessada a influência endógena, a microbiota necessariamente adaptou-se a um 
26 
 
ambiente onde apenas a anilina estava disponível como única fonte de carbono e 
energia no meio. 
 
5.2 DIVERSIDADE 
 
A composição taxonômica da comunidade microbiana, presente no inóculo (CPI) 
e nos microcosmos contendo anilina (CPF), foi analisada através do sequenciamento 
do 16S rDNA. A primeira amostra foi retirada da biomassa utilizada como inóculo dos 
microcosmos, essa amostra representa a comunidade microbiana inicial, antes de ser 
utilizada no teste de biodegradação da anilina. A segunda amostra foi retirada dos 
microcosmos no dia 210 do experimento, e representa a mudança que a comunidade 
presente no inóculo sofreu, em função da exposição ao substrato disponível (anilina). 
A princípio, quando se observa os dados do sequenciamento das duas 
comunidades (CPI e CPF) é possível verificar um declínio no número de unidades 
taxonômicas operacionais (OTU) a nível de gênero em CPF, quando comparada a 
CPI. Uma explicação possível para essa diminuição no número de OTUs, é 
sustentada pela menor diversidade e disponibilidade de substrato presentes no teste 
de degradação da anilina. Enquanto no efluente petroquímico estavam disponíveis 
diversos compostos orgânicos, podendo ser nitrogenados (toluamida), sulfurados 
(Benzotiofeno), além de diversos álcoois, cetonas e fenóis (BOTALOVA et al., 2009), 
nos microcosmos, a única fonte de carbono e energia disponível era a anilina, o que 
restringe a comunidade microbiana presente. 
 
Tabela 2. Resultados dos índices de diversidade calculados para a comunidade microbiana 
do inóculo (CPI) e do final do tratamento (CPF). 
 
Fonte: Autor (2021) 
Análises CPI CPF
OTUs 44 33
Sequências 31919 24431
Shannon H 1,265 1,209
Simpsom 1-D 0,493 0,587
Dominance D 0,506 0,412
Berger-Parker 0,702 0,584
Índices de diversidade
27 
 
Quanto à alfa diversidade, o primeiro índice a ser destacado é de Shannon (H), 
apesar da diminuição no número de OTUs, a diversidade de Shannon não teve grande 
alteração. Este índice pode ser definido como uma medida de riqueza e equitabilidade 
de espécies, atribuindo um maior peso a espécies raras e sendo sensível a variações 
na abundância. Dessa forma, o índice de Shannon sugere que além da diminuição no 
número geral de OTUs, também ocorreu uma diminuição de dominância de gêneros 
em CPF, e que gêneros antes abundantes em CPI, tornaram-se mais raros em CPF. 
O índice de Simpson (1-D) calcula a diversidade de forma similar ao de Shannon, 
no entanto ele dá maior peso a espécies comuns, neste é avaliada a probabilidade de 
2 indivíduos aleatórios de uma comunidade de pertencerem a mesma espécie, quanto 
maior o resultado maior essa probabilidade. É possível observar que essa 
probabilidade é maior em CPF quando comparada com CPI. No entanto, a diminuição 
da dominância em CPF, indica que o aumento da abundância de gêneros comuns 
ocorreu de forma mais distribuídas (várias espécies aumentaram abundância 
simultaneamente), quando comparado a CPI, que apresentou maior dominância, logo 
maior abundância concentrada em um menor número de gêneros, o que também é 
corroborado pelo índice de Berguer-Parker. 
Os resultados de alfa diversidade indicam que apesar da anilina ser consumida 
em diversas injeções (mostrando a capacidade metabólica da comunidade 
microbiana), a sua presença exerceu pressão seletiva sobre a comunidade microbiana 
inicial (CPI) gerando uma comunidade final (CPF) estruturalmente distinta na 
proporção em que a abundância se distribui entre os diferentes táxons da 
comunidade. 
Logo, é possível afirmar que o resultado em CPF foi a diminuição de OTUs, 
extinguindo os táxons que não apresentaram a capacidade de utilizar a anilina ou seus 
subprodutos. Também ocorreu a diminuição do número de espécies abundantes, e 
uma menor dominância entre as espécies abundantes. Esse último fator sugere que 
mais de uma espécie poderiam estar sendo beneficiadas pela degradação da anilina, 
sendo participativas de sua rota metabólica. 
5.3 TAXONOMIA 
 
Os dados taxonômicos de ambas as comunidades (CPI e CPF) corroboram com 
a alfa diversidade, discutida anteriormente. Na distribuição taxonômica presente em 
28 
 
CPI é possível observar 11 gêneros relevantes (com abundância relativa >1%), já em 
CPF apenas 6 apresentaram essaabundância. Nos táxons pertencentes ao grupo de 
maior relevância, em ambas as comunidades, o metabolismo é predominantemente 
fermentativo e metanogênico. 
 
Figura 7. Comparação taxonômica entre CPI e CPF 
 
Fonte: Autor (2021) 
 
Outro aspecto importante a ser ressaltado é que tanto CPI quanto CPF 
apresentaram os mesmos quatro gêneros com maior abundância relativa, sendo eles 
Syntrophus, Methanosaeta, Methanobacterium e Petrimonas. A única diferença está 
da distribuição da abundância desses quatro gêneros, CPI apresentou uma 
monodominacia do gênero Syntrophus (AR = 70,25%), já CPF deve uma abundância 
mias distribuída com Methanosaeta apresentando a maior dominância (AR = 58,46%) 
seguida de Syntrophus (AR = 25,11%), Petrimonas (AR = 6,64%) e Methanobacterium 
(AR = 5,24%). 
O gênero Syntrophus apresentou uma abundância relativa bastante elevada em 
ambas as comunidades (AR = 70,25% em CPI e AR = 25,11% em CPF). Esse gênero 
já foi caracterizado como sendo capaz de obter energia de uma grande variedade de 
compostos orgânicos como como álcoois, AGVs, ácidos aromáticos (benzoato), 
29 
 
ácidos orgânicos e hidrocarbonetos (MCINERNEY et al., 2007). No entanto, essas 
reações são endergônicas, logo só poderiam acontecer na ausência ou em baixos 
níveis de formiato e hidrogênio. Dessa forma esse táxon necessita estabelecer uma 
relação sintrófica com arqueas metanogênicas ou outros gêneros que utilizam esses 
compostos, controlando suas concentrações no ambiente. Na tabela 3 estão descritas 
algumas reações propostas por Mcinerney et al. (2007), que demonstram como 
funciona o metabolismo sintrófico desses gêneros. 
 
Tabela 3. Esquema das reações 
 
Fonte: Adaptado de Mcinerney et al. (2007) 
 
A abundância de Methanobacterium (AR = 5,24%), gênero caracterizado por 
fazer uso de hidrogênio e fumarato no seu metabolismo para a produção de metano 
(hidrogenotrófica) (KATO; HASHIMOTO; WATANABE, 2012), indica essa possível 
relação sintrófica com o gênero Syntrophus. Petrimonas (AR = 6,64) é relatado na 
literatura apresentando um metabolismo acetogênico, com a capacidade de utilizar 
ácidos orgânicos como fonte de energia(GRABOWSKI et al., 2005), de forma 
semelhante à Syntrophus. Além disso, é bastante relevante a presença do gênero 
Methanosaeta (AR = 58,46%) que é favorecido pela presença de acetato derivado da 
degradação dos substratos orgânicos disponíveis (ELDER e KELLY, 1994), neste 
caso o ácido benzoico proveniente da degradação da anilina pode ser convertido a 
acetato, apesar de não avaliado neste trabalho. 
Durante o monitoramento, a presença do ácido benzoico nos microcosmos, em 
concentrações entre 0,2 à 1,8 mg/L, indicam que a rota de degradação da anilina neste 
caso acontece por via de carboxilação e desaminação conforme ilustrado na Figura 8 
Entretanto, não é possível afirmar se houve etapas intermediárias entre esses dois 
processos, uma vez que nesse experimento só foi monitorado o ácido benzoico como 
intermediário, o que dificulta prever a rota de degradação completa. 
Reações ΔG
0
 (kJ/mol) ΔG (kJ/mol)
Metanogênese hidrogenotrófica
4H2 + HCO3
-
 + H
+
 → CH4 + 3H2O -135,6 -15,8
Propionato- + 3H2O → acetato
-
 + HCO3
-
 + H+ + 3H2 76,1 -16,9
Butirato- + 2H2O → 2 acetato
-
 + H
+
 + 2H2 48,6 -39,2
Benzoato- + 7H2O → 3 acetato
-
 + HCO3
-
 + 3H
+
 + 3H2 70,1 -68,5
Metabolismo sintrófico
30 
 
 
Figura 8. Inferência da rota de degradação da anilina 
Fonte: Autor (2021). O tracejado vermelho indica os compostos identificados durando o experimento. 
 
Portanto é possível afirmar que a Cultura proveniente de efluente petroquímico 
apresentou a capacidade de degradar anilina por via de formação de ácido benzoico 
(benzoato). A abundância relativa dos gêneros dominantes da comunidade foi 
significativamente alterada, indicando que a comunidade microbiana estabeleceu uma 
configuração de relações tróficas focadas no metabolismo de quatro gêneros 
principais (Syntrophus, Methanosaeta, Methanobacterium e Petrimonas). Nesse 
contexto, a CPI apresentou um perfil mais monodominante com o gênero Syntrophus 
em destaque e CPF apresentou uma distribuição mais equilibrada da abundância 
relativa entre os gêneros Syntrophus, Methanosaeta, Methanobacterium e Petrimonas 
indicando uma possível relação sintrófica metanogênica entre esses gêneros, 
representada na Figura 9. 
 
Figura 9. Esquema representativo da relação entre os gêneros Syntrophus, Petrimonas, 
Methanobacterium e Methanosaeta 
Fonte: Autor (2021) 
31 
 
Diversos trabalhos relatam a importância da relação sintrófica entre bactérias 
diretamente ligadas com a redução de compostos aromáticos e as bactérias 
metanogênicas. No trabalho de (BERDUGO-CLAVIJO et al., 2012) foi relatada a 
importância do gênero Methanosaeta, no consumo de acetato e hidrogênio durante a 
degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. O gênero Methanobacterium 
também foi relatado em uma relação sintrófica metanogênica (dependente de 
hidrogênio e fumarato) na degradação anaeróbia de naftaleno, 2-metilnaftaleno e 
antraceno (YE et al., 2019). 
Em nenhum dos microcosmos da triplicata inoculados com a cultura 
petroquímica foi registrada a formação do intermediário central catecol, formado 
geralmente a partir das ações de enzimas monoxigenases e dioxigenases produzidas 
por microrganismos aeróbios. Este fato indica que o ambiente dentro dos 
microcosmos foi bem controlado quanto a interferência do oxigênio atmosférico, o que 
assegurou a anaerobiose como ambiente predominante. 
 
32 
 
6 CONCLUSÃO 
 
Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a cultura proveniente de um 
reator do tipo UASB, adaptada ao tratamento de efluente petroquímico, foi capaz de 
degradar anilina em condição anaeróbia estrita. Esses resultados corroboram com a 
hipótese de que culturas microbianas que se desenvolvem em ambientes contendo 
compostos orgânicos de difícil degradação (neste caso os BTEX presentes no efluente 
petroquímico), conseguem desenvolver uma estrutura metabólica que pode ser 
explorada e utilizada para biorremediação e tratamento de outros compostos 
recalcitrantes de interesse, como a anilina. 
Foi possível observar que a exposição da comunidade microbiana à anilina, 
promoveu um efeito seletivo na estrutura taxonômica e nos índices de alfa diversidade 
da comunidade microbiana inicial, utilizada como inóculo. Esta pressão seletiva incidiu 
na microbiota de forma a diminuir o número de táxons e alterando a abundância 
relativa dos táxons remanescentes. Porém a predominância do metabolismo 
metanogênico foi mantida, na comunidade final. 
A detecção de ácido benzoico durante os testes de biodegradação, indica que a 
possível rota de degradação da anilina seria por carboxilação, seguida de 
desaminação, contudo para entender a rota completa é necessário monitorar outros 
possíveis compostos intermediários. 
Este trabalho contribuiu para melhor compreensão de como a anilina pode 
modificar uma comunidade microbiana anaeróbia, além de contribuir para o 
entendimento da biorremediação deste contaminante. No entanto são necessários 
mais estudos, que monitorem os metabolitos intermediários, para um melhor 
entendimento da rota de degradação da anilina. Além disso, o isolamento da 
comunidade microbiana através de técnicas de seleção de microrganismos, pode 
gerar uma cultura ainda mais especializa, permitindo aprofundar o nível de detalhes 
sobre os metabolismos das espécies envolvidas diretamente na biodegradação. 
 
 
 
 
 
 
33 
 
REFERÊNCIAS 
 
ABDULSALAM, S. et al. Comparison of biostimulation and bioaugmentation for 
remediation of soil contaminated with spent motor oil. International Journal of 
Environmental Science and Technology, v. 8, n. 1, p. 187–194, 2011. 
 
ABIT. Associação Brasileira da Indústria Têxtil e de Confecção. Indústria Têxtil e de 
Confecção Brasileira, 2020. Disponívelem: < http://www.abit.org.br/cont/perfil-do-
setor >. Acesso em: 12 de fevereiro de 2021. 
 
ADAMS, R. Dic Will Buy Basf’S Global Pigments Business for $1.1 Billion. Focus on 
Pigments, v. 2019, n. 8, p. 1–3, 2019. 
 
DINO, A. Anli et al. Biodegradation of aniline from textile industry waste using salt 
tolerant Bacillus firmus BA01. Engineering in Agriculture, Environment and Food, 
v. 12, n. 3, p. 360-366, 2019. 
 
BAUDROT, V. et al. Effects of contaminants and trophic cascade regulation on food 
chain stability: Application to cadmium soil pollution on small mammals – Raptor 
systems. Ecological Modelling, v. 382, n. May, p. 33–42, 2018. 
 
BERDUGO-CLAVIJO, Carolina et al. Methanogenic biodegradation of two-ringed 
polycyclic aromatic hydrocarbons. FEMS microbiology ecology, v. 81, n. 1, p. 124-
133, 2012. 
 
BOTALOVA, O. et al. Identification and chemical characterization of specific organic 
constituents of petrochemical effluents. Water Research, v. 43, n. 15, p. 3797–3812, 
2009. 
 
CÂMARA, Isabelle Rodrigues de Mendonça. Influência da microaeração intermitente 
na degradação anaeróbia da anilina. 2021. Disertação (Mestrado em Engenharia 
Civil) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2021. 
 
CARVALHO, José Roberto Santo de. Degradação anaeróbia de anilina utilizando 
diferentes culturas microbianas. 2020. Tese (Doutorado em Engenharia Civil) - 
Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2020. 
 
CHINADAILY. Chemical leak into river puts focus on plant. 11 de janeiro de 2013. 
Disponível em: <http://usa.chinadaily.com.cn/epaper/2013-
01/11/content_16105865.htm> Acesso em: 13 de fevereiro de 2021. 2021a. 
 
CHINADAILY. High levels of aniline found in Hebei water supply. 08 de abril de 2013. 
Disponível em: <http://www.chinadaily.com.cn/china/////2013-
04/08/content_16384273.htm > Acesso em: 13 de fevereiro de 2021. 2021b. 
 
CUI, D. et al. Biodegradation of aniline by a novel bacterial mixed culture AC. 
International Biodeterioration and Biodegradation, v. 125, p. 86–96, 2017. 
 
DE FIGUEIREDO, A. P. M. et al. Intoxicação experimental por indigofera suffruticosa 
34 
 
em caprinos e ovinos. Pesquisa Veterinaria Brasileira, v. 32, n. 2, p. 126–130, 
2012. 
 
DURRENS, P. et al. Microbiology 9. p. 121–124, 1981. 
 
EDWARDS, ELIZABETH A.; GRBIĆ-GALIĆ, Dunja. Anaerobic degradation of 
toluene and o-xylene by a methanogenic consortium. Applied and Environmental 
Microbiology, v. 60, n. 1, p. 313-322, 1994. 
 
ELDER, Douglas JE; KELLY, David J. The bacterial degradation of benzoic acid and 
benzenoid compounds under anaerobic conditions: unifying trends and new 
perspectives. FEMS microbiology reviews, v. 13, n. 4, p. 441-468, 1994. 
 
GAMA, Nuno V.; FERREIRA, Artur; BARROS-TIMMONS, Ana. Polyurethane foams: 
Past, present, and future. Materials, v. 11, n. 10, p. 1841, 2018. 
 
GRABOWSKI, A. et al. Petrimonas sulfuriphila gen. nov., sp. nov., a mesophilic 
fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir. International 
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 55, n. 3, p. 1113–1121, 
2005. 
 
HUANG, J. et al. International Biodeterioration & Biodegradation Microbial 
biodegradation of aniline at low concentrations by Pigmentiphaga daeguensis 
isolated from textile dyeing sludge. International Biodeterioration and 
Biodegradation, v. 129, n. 100, p. 117–122, 2018a. 
 
HUANG, J. et al. Microbial biodegradation of aniline at low concentrations by 
Pigmentiphaga daeguensis isolated from textile dyeing sludge. International 
Biodeterioration and Biodegradation, v. 129, n. 100, p. 117–122, 2018b. 
 
JIANG, Y. et al. Characterization and biodegradation potential of an aniline-
degrading strain of Pseudomonas JA1 at low temperature. Desalination and Water 
Treatment, v. 57, n. 52, p. 25011–25017, 2016. 
 
KATO, Souichiro; HASHIMOTO, Kazuhito; WATANABE, Kazuya. Methanogenesis 
facilitated by electric syntrophy via (semi) conductive iron‐oxide minerals. 
Environmental microbiology, v. 14, n. 7, p. 1646-1654, 2012. 
 
KEYHANIAN, M.; FARMANZADEH, D. The role of Mn and Fe transition metal atoms 
mediation on the aniline adsorption by B 40 fullerene : A computational investigation. 
Journal of Molecular Liquids, v. 294, p. 111638, 2019. 
 
KISHOR, R. et al. Journal of Environmental Chemical Engineering Ecotoxicological 
and health concerns of persistent coloring pollutants of textile industry wastewater 
and treatment approaches for environmental safety. Journal of Environmental 
Chemical Engineering, v. 9, n. 2, p. 105012, 2021. 
 
LENDVAY, J. M. et al. Bioreactive barriers: a comparison of bioaugmentation and 
biostimulation for chlorinated solvent remediation. Environmental Science & 
Technology, v. 37, n. 7, p. 1422-1431, 2003. 
35 
 
 
MAKHDOUMI, Pouran et al. Molecular mechanism of aniline induced spleen toxicity 
and neuron toxicity in experimental rat exposure: a review. Current 
neuropharmacology, v. 17, n. 3, p. 201-213, 2019. 
 
MCINERNEY, M. J. et al. The genome of Syntrophus aciditrophicus: Life at the 
thermodynamic limit of microbial growth. Proceedings of the National Academy of 
Sciences of the United States of America, v. 104, n. 18, p. 7600–7605, 2007. 
 
METHNENI, Nosra et al. Persistent organic and inorganic pollutants in the effluents 
from the textile dyeing industries: Ecotoxicology appraisal via a battery of biotests. 
Environmental Research, v. 196, p. 110956, 2021. 
 
MOHAMMED, Mujahid et al. New insights into aniline toxicity: Aniline exposure 
triggers envelope stress and extracellular polymeric substance formation in 
Rubrivivax benzoatilyticus JA2. Journal of hazardous materials, v. 385, p. 121571, 
2020. 
 
MUYZER, Gerard; SMALLA, Kornelia. Application of denaturing gradient gel 
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in 
microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek, v. 73, n. 1, p. 127-141, 1998. 
 
PARSHETTI, G. K. et al. Decolorization and detoxification of sulfonated azo dye 
methyl orange by Kocuria rosea MTCC 1532. Journal of Hazardous Materials, v. 
176, n. 1–3, p. 503–509, 2010. 
 
SCHNELL, S.; BAK, F.; PFENNIG, N. Anaerobic degradation of aniline and 
dihydroxybenzenes by newly isolated sulfate-reducing bacteria and description of 
Desuifobacterium anilini. Archives of Microbiology, v. 152, p. 556–563, 1989. 
 
SCHNELL, S.; SCHINK, B. Anaerobic aniline degradation via reductive deamination 
of 4-aminobenzoyl-CoA in Desulfobacterium anilini. Archives of Microbiology, v. 
155, n. 2, p. 183–190, 1991. 
 
SOLOMONS, T. W. G.; FRYHLE, C. B. Alcenos e Alcinos II: Reações de Adição. 
Química Orgânica, cap, v. 8, n. 8, p. 0-5, 2005. 
 
SUN, Weimin et al. Identification of anaerobic aniline-degrading bacteria at a 
contaminated industrial site. Environmental science & technology, v. 49, n. 18, p. 
11079-11088, 2015. 
 
TANG, H. et al. Photochemical removal of aniline in aqueous solutions: Switching 
from photocatalytic degradation to photo-enhanced polymerization recovery. Journal 
of Hazardous Materials, v. 175, n. 1–3, p. 977–984, 2010. 
 
TEKLE-RÖTTERING, Agnes et al. Ozonation of anilines: Kinetics, stoichiometry, 
product identification and elucidation of pathways. Water research, v. 98, p. 147-
159, 2016. 
 
WANG, D.; ZHENG, G.; WANG, S.; ZHANG, D.; ZHOU, L. Biodegradation of aniline 
36 
 
by Candida tropicalis AN1 isolated from aerobic granular sludge. Journal of 
Environmental Sciences, v. 23, n. 12, p. 2063–2068, dez. 2011. 
 
WYNDHAM, R. C. Evolved aniline catabolism in Acinetobacter calcoaceticus during 
continuous culture of river water. Applied and Environmental Microbiology, v. 51, 
n. 4, p. 781–789, 1986. 
 
YE, Q. et al. ScienceDirect Molecular characterization of methanogenic microbial 
communities for degrading various types of polycyclic aromatic hydrocarbon. Journal 
of Environmental Sciences, v. 86, p. 97–106, 2019.