Relatório bioquímica - Propriedades Fisico-quimicas das proteinas e dosagem pelo metodo biureto

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Coordenadoria de Biotecnologia
Curso de Bioquímica
Práticas:
Propriedades Físico-Químicas de Proteínas 
&
Dosagem de Proteínas pelo Método do Biureto
Alunos: Caio Philippe (nº06), Petterson Nuremberg (nº20), Renato Simões (nº24) e Vivianne Rufino (nº25).
Turma: QM161.
Professores: Ana Carolina e Michelle Castro.
Data da realização da prática: 16 de Agosto de 2010.
Data da entrega do relatório: 23 de Agosto de 2010.
Avaliação:
	Critério:
	Nota:
	Apresentação
	
	Introdução
	
	Objetivos
	
	Métodos
	
	Resultados
	
	Discussão
	
	Bibliografia
	
	Total:
	
SUMÁRIO
	INTRODUÇÃO TEÓRICA
	
	03
	OBJETIVOS
	
	04
	MATERIAL
	
	04
	MÉTODOS
	
	06
	RESULTADOS
	
	08
	DISCUSSÃO
	
	10
	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
	
	12
I. Introdução Teórica
Proteínas são polímeros cujos monômeros são os aminoácidos, ligados entre si por ligações peptídicas (Figura 1.). Elas exercem várias funções no organismo, como transporte, sinalização, defesa, movimento, atividade catalítica e até mesmo função estrutural.
Figura 1: Esquematização de uma ligação peptídica.
Toda cadeia polipeptídica possui estrutura primária, que é a sequência linear de aminoácidos que a compõe. A estrutura secundária é a organização de forma regular dos resíduos de aminoácidos próximos entre si. As principais estruturas secundárias são: α-hélice, folha β-pregueada, e curva em β. Todas as estruturas secundárias são estabilizadas por pontes de hidrogênio. A estrutura terciária é a estrutura final de um monômero, pode incluir estruturas secundárias e randômicas (estruturas sem nenhum padrão). As forças estabilizadoras da estrutura terciária podem ser: pontes de hidrogênio, pontes salinas, pontes dissulfeto e interações hidrofóbicas. Uma proteína terá estrutura quaternária quando for formada por mais de uma cadeia polipeptídica (monômero).
As proteínas são divididas em dois grandes grupos: globulares e fibrosas. As globulares geralmente são solúveis e possuem uma conformação tridimensional mais compacta, enquanto as fibrosas apresentam maior grau de organização (formação de fibras) e possuem estruturas mais padronizadas.
Alguns fatores podem alterar a estrutura estável de uma proteína. Em alguns casos, esta alteração leva à desnaturação: uma mudança na estrutura nativa que causa perda de funcionalidade, e possivelmente de solubilidade. Esse processo pode ser reversível ou não, dependendo do grau de alteração estrutural e complexidade da proteína. Vários fatores podem alterar a estrutura tridimensional protéica. Dentre eles, os principais são: temperatura, pH, concentração salina, solventes orgânicos, agentes caotrópicos e agentes redutores.
A ovoalbumina é uma glicoproteína de estrutura terciária homóloga, encontrada na clara de ovo, correspondendo a cerca de 60% das proteínas totais do ovo. Sua função é desconhecida, embora se presuma que seja uma proteína de estoque de nutrientes.
A caseína é uma proteína encontrada no leite de vaca, correspondendo a cerca de 80% deste. Está ligada à íons cálcio (Ca+2), e não pode ser coagulada por altas temperaturas (a pasteurização do leite comprova este fato), mas por ácidos e alguns tipos de enzimas - as enzimas proteolíticas - tipicamente obtidas do estômago do bezerro.
II. Objetivos
1. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
Observar a influência de alterações do meio (temperatura, pH, concentração iônica, adição de solventes orgânicos e de agentes caotrópicos) em soluções de caseína e ovoalbumina, e verificar a reversibilidade destas alterações.
2. DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
Determinar a concentração de caseína em uma amostra através da confecção de uma Curva Padrão de Absorbância no comprimento de onda de 540nm, utilizando o método do Biureto.
III. Material e Métodos
a. Material
1. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
A. Material por Grupo:
· 2 Pipetas de 2mL;
· 3 Pipetas de 5mL;
· 1 Pipeta de 10mL;
· 1 Pró-Pipete;
· 12 Tubos de Ensaio.
B. Equipamentos:
· Banho-Maria;
Marca: DELEO nº150 tipo:1097 AMP:2,8 voltagem: 220V
· Vortex; 
Marca: Vertex Modelo: QL-901 Voltagem: AC 110V
· Centrífuga : 
Marca: Centribio TDL80-2B
C. Reagentes: 
· Solução de Sulfato de Amônio ((NH4)2SO4) 60% p/v;
· Solução de Uréia 8M;
· Tampão fosfato com salina (PBS) pH 7,4;
· Acetona P.A. (na capela);
· Solução de ácido sulfúrico 6M
D. Amostras de Proteínas:
· Ovoalbumina (clara de ovo diluída em PBS 1:25 v/v);
· Caseína diluída em PBS 1mg/mL.
2. DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
A. Material por Grupo:
· 7 Tubos de Ensaio;
· 3 Pipetas de 2mL;
· 1 Pipeta de 5mL;
· 1 Pró-Pipete;
· 1 Becker de 50mL;
· 6 Cubetas.
B. Equipamento: 
· Espectrofotômetro: Shimadzu UV mini-1240
C. Reagentes:
· Solução Padrão de Caseína (5mg/mL) em PBS pH 7,4;
· Amostra de caseína de concentração desconhecida [?] em PBS pH 7,4;
· Reagente do Biureto:
CuSO4. 5 H2O 0,15% p/v 
Tartarato duplo de sódio e potássio 0,60% p/v
KI 1,00% p/v
em NaOH 1,00 mol/L
· PBS pH 7,4 (Tampão fosfato com salina em pH 7,4):
KCl 2,680 mmol/L
KH2PO4 1,470 mmol/L 
NaC 0,137 mmol/L
Na2HPO4. 7 H2O 8,060 mmol/L
b. Métodos
1. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
Transferiram-se alíquotas de soluções protéicas de caseína e ovoalbumina para tubos previamente numerados de 1 a 10. A solução de ovoalbumina foi distribuída nos tubos com numeração ímpar, enquanto a solução de caseína foi distribuída nos tubos com numeração par, conforme a tabela abaixo:
	Tubo
	Ovoalbumina
	Caseína
	Ensaio
	1
	4 mL
	-
	Efeito da temperatura
	2
	-
	4 mL
	Efeito da temperatura
	3
	2 mL
	-
	Efeito de solventes orgânicos
	4
	-
	2 mL
	Efeito de solventes orgânicos
	5
	1 mL
	-
	Efeito de altas concentrações salinas
	6
	-
	1 mL
	Efeito de altas concentrações salinas
	7
	2 mL
	-
	Efeito de ácidos fortes
	8
	-
	2 mL
	Efeito de ácidos fortes
	9
	2 mL
	-
	Efeito de agentes caotrópicos
	10
	-
	2 mL
	Efeito de agentes caotrópicos
Tabela 1: Relação das alterações sofridas pelas soluções nos respectivos tubos.
Nos tubos 1 e 2, colocou-se 4 mL de cada solução protéica. Incubaram-se os dois tubos em banho-maria durante 10 minutos. Seus aspectos foram observados e então os tubos foram reservados.
Nos tubos 3 e 4, colocou-se 2 mL de cada solução protéica e, após isso, transferiu-se 2 mL de solução de acetona para cada tubo, na capela. Homogeneizou-se e os resultados foram observados. Reservou-se o material.
Nos tubos 5 e 6, colocou-se 1 mL de cada solução protéica, e, após isso, transferiu-se 4 mL de solução de sulfato de amônio para cada tubo. Homogeneizou-se, observaram-se os aspectos das amostras e, então, o material foi reservado. 
Nos tubos 7 e 8, colocou-se 2 mL de cada solução protéica, e após isso, transferiu-se 2 mL de solução de ácido sulfúrico para cada tubo, na capela. Após homogeneização, os aspectos das amostras foram observados e, posteriormente, reservou-se o material. 
Nos tubos 9 e 10, colocou-se 2 mL de cada solução protéica e, em seguida, 2 mL de solução de uréia 8M em cada tubo. Homogeneizou-se e os resultados foram observados. Reservou-se o material.
Os tubos que sofreram alteração foram levados à centrífuga, todos com seu par, ainda que este não tenha sofrido alteração, para funcionarem como contrapeso. Após 5 minutos na centrífuga a 3000 RPM, os tubos que apresentaram formação de “pellet” (precipitado) foram reservados e o sobrenadante de cada um foi retirado. 
Foram adicionados 6 mL de PBS aos precipitados, homogeneizou-se e, com auxílio do Vortex, tentou-se ressolubilizar o “pellet”.
2. DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
Foi transferida uma alíquota de solução padrão de caseína 5mg/mL para um becker, e este foi levado para a bancada, a fim de se fazer diferentes diluições da solução protéica através da adição de PBS e biureto, como descrito na tabela abaixo:
	Tubo
	PBS (mL)
	Solução Padrão de Caseína (mL)
	Solução [?] de Caseína (mL)
	Biureto (mL)
	B
	2,0
	-
	-
	5,0
	1
	1,5
	0,5
	-
	5,0
	2
	1,0
	1,0
	-
	5,0
	3
	0,5
	1,5
	-
	5,0
	4
	-
	2,0
	2,0
	5,0
	5
	-
	-
	
	
Tabela 2: Composiçãodas soluções de cada tubo.
A adição dos reagentes aos tubos foi feita na mesma ordem em que estes estão organizados na tabela, da esquerda para a direita. O tubo B (branco) foi utilizado como a tara do espectrofotômetro, e no tubo 5 não foi adicionada solução padrão, e sim uma solução de concentração desconhecida de caseína. O volume final em todos os tubos – incluindo o branco e o tubo 5 – era rigorosamente 7 mL. 
Os tubos foram homogeneizados e incubados a temperatura ambiente por 15 minutos. Passado este tempo, as soluções foram transferidas para seis cubetas, enchendo-as até acima da metade, e a absorbância de cada uma foi lida no comprimento de onda de 540 nm, no espectrofotômetro. Um gráfico da curva padrão de absorbância da caseína foi feito através dos resultados obtidos, para possibilitar o cálculo da concentração da amostra desconhecida.
IV. Resultados
1. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
a. Efeito da Temperatura (tubos 1 e 2):
A solução 1 (ovoalbumina) apresentou coloração branca e aspecto coloidal, enquanto a solução 2 (caseína) se manteve incolor e sem alterações na textura. Após a centrifugação de ambos os tubos, a solução 1 permaneceu com turvação, sem decantação, e a solução 2 permaneceu homogênea. Como não foi possível separar o precipitado do sobrenadante, não foi realizado o ensaio de ressolubilização com PBS.
b. Efeito de Solventes Orgânicos (tubos 3 e 4):
	Ao adicionar acetona às soluções 3 (ovoalbumina) e 4 (caseína), houve uma turvação muito forte da solução 3, mas nenhuma da solução 4. Após a centrifugação, a solução 4 permaneceu homogênea, enquanto na 3 houve depósito completo de precipitado no fundo do tubo. Este foi separado do sobrenadante, e foi realizada a adição de PBS e posterior agitação no Vortex. A adição de PBS não levou à ressolubilização do “pellet”.
c. Efeito de Altas Concentrações Salinas (tubos 5 e 6):
	Ao adicionar sulfato de amônio às soluções 5 (ovoalbumina) e 6 (caseína), houve turvação na solução 5, enquanto que a 6 permaneceu homogênea. Os tubos foram levados à centrífuga e houve formação de precipitado nos dois, contudo não houve precipitação completa do “pellet” em nenhum deles. Portanto, não foi possível realizar a total retirada do sobrenadante. Com a adição de PBS e posterior agitação dos tubos no Vortex, ambos os precipitados ressolubilizaram.
d. Efeito de Ácidos Fortes (tubos 7 e 8):
	Ao adicionar ácido sulfúrico às soluções 7 (ovoalbumina) e 8 (caseína), ambas ficaram turvas, com formação de precipitado no fundo do tubo 8. Após a centrifugação, a solução 7 também apresentou deposição de precipitado. A decantação não foi completa no tubo 7, portanto, não foi possível a total retirada do sobrenadante. Na solução do tubo 8, a decantação foi completa. Nenhuma das duas soluções ressolubilizou após a adição de PBS e posterior agitação no Vortex.
e. Efeito de Agentes Caotrópicos (tubos 9 e 10):
	Não houve qualquer mudança nas soluções 9 e 10 após feita a reação ambas soluções continuaram homogêneas e transparentes, portanto, esses tubos não foram centrifugados.
	Os resultados foram resumidos na tabela abaixo:
	Tubo
	Ovoalbumina
	Caseína
	Antes da Centrifugação
	Depois da Centrifugação
	1
	4 mL
	-
	Turva
	Turva
	2
	-
	4 mL
	Homogênea
	Homogênea
	3
	2 mL
	-
	Muito turva
	Decantação Completa do “pallet”
	4
	-
	2 mL
	Homogênea
	Homogênea
	5
	1 mL
	-
	Turva
	Turva e com “pallet” no fundo
	6
	-
	1 mL
	Homogênea
	Turva e com “pallet” no fundo
	7
	2 mL
	-
	Turva
	Turva e com “pallet” no fundo
	8
	-
	2 mL
	Turva e com “pallet” no fundo
	Decantação completa do “pallet”
	9
	2 mL
	-
	Homogênea
	-
	10
	-
	2 mL
	Homogênea
	-
Tabela 3: Aspectos das soluções após as respectivas mudanças do meio; relação entre a formação de precipitado antes e depois da centrifugação.
	Portanto, somente as soluções 3, 5, 6, 7 e 8 tiveram deposição de precipitado no fundo do tubo. Logo, estes foram submetidos ao tratamento com PBS.
	Somente as soluções que sofreram aumento de concentração salina (tubos 5 e 6) tiveram o precipitado ressolubilizado após o tratamento.
2. DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
	A solução padrão de caseína 5 mg/mL sofreu três diferentes diluições, através da adição de PBS. As novas concentrações de caseína nos tubos estão tabeladas abaixo, bem como a absorbância de cada solução no comprimento de onda de 540 nm.
	Tubo
	Concentração Final de Caseína (mg/mL)
	Absorbância (540 nm)
	B
	-
	0 (considerada 0, tarando o aparelho)
	1
	1,25
	0,084
	2
	2,50
	0,175
	3
	3,75
	0,227
	4
	5,00
	0,316
	5
	-
	0,126
Tabela 4: Relação entre a concentração de caseína nos tubos e a absorbância desta em cada solução.
	Os valores obtidos foram marcados em um gráfico, sendo a concentração, o eixo x (fator controlado), e a absorbância lida, o eixo y (dado que se deseja obter). A partir destes pontos, foi traçada a melhor tendência, que é definida como Curva Padrão de Absorbância da Caseína.
	Foi calculada a equação da reta da curva padrão, utilizando dois pontos pertencentes a ela: (0; 0) e (3,75; 0,227). Devido ao fato da reta passar pela origem do plano cartesiano, o valor de “b” (coeficiente linear) equivale a 0 (zero). Logo:
b = 0 :. y = a.x + 0
0,227 = 3,75.a :. a = 0,0605 = 6,05.10-2
	Logo, a equação da reta do gráfico de concentração “x” absorbância da caseína é:
	y = 6,05.10-2.x
	Através desta equação é possível calcular a concentração da amostra do tubo 5, cuja absorbância medida a 540 nm foi 0,126:
0,126 = 6,05.10-2.x :. x = 2,08 mg/mL
	Portanto, a concentração de caseína na amostra do tubo 5 encontrada foi de 2,08 mg/mL.
V. Discussão
1. PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
A adição de PBS aos precipitados - a fim de ressolubilizá-los - é importante, pois fornece o meio necessário para a reestabilização da estrutura nativa da proteína, e conseqüente solubilização desta.
a. Efeito da Temperatura (tubos 1 e 2):
Grande parte das proteínas pode sofrer desnaturação a partir do aumento da temperatura: o fornecimento de calor aumenta a agitação molecular, favorecendo o rompimento das estruturas não-covalentes que estabilizam a estrutura nativa protéica. A turvação na solução de ovoalbumina constata que esta sofreu desnaturação, o que levou a perda de solubilidade. A irreversibilidade desta alteração foi comprovada através da incubação da proteína desnaturada à temperatura ambiente: o aspecto da solução continuou turvo, levando à conclusão que a ovoalbumina não retornou à estrutura nativa. A caseína não sofreu nenhuma alteração ao ser incubada à alta temperatura – como previsto na teoria - pois as interações desta proteína com o meio são fortes o suficiente para não serem rompidas através do aquecimento, mantendo a estrutura tridimensional nativa.
b. Efeito de Solventes Orgânicos (tubos 3 e 4):
A acetona tem a capacidade de romper as interações hidrofóbicas das proteínas. Isto afeta principalmente as proteínas globulares, por serem mais sensíveis. Desta forma, ao haver turvação na solução 3 (ovoalbumina), pode-se concluir que este solvente orgânico atuou diretamente nas interações hidrofóbicas, perturbando o interior protéico e levando à desnaturação. Com relação ao tubo 4 (caseína), não ocorreu nada, levando à conclusão de que esta não faz interações hidrofóbicas o suficiente para que a adição da acetona a desnature. Após a adição de PBS ao tubo 3, o precipitado não ressolubilizou, indicando que a desnaturação foi irreversível.
c. Efeito de Alta Concentração Salina (tubos 5 e 6):
Quando se adiciona sal a uma proteína, a solubilidade desta tende a aumentar, devido à maior interação entre a proteína e o meio, mediada pelo eletrólito. Entretanto, se a adição de sal é muito grande, as moléculas de água passam a interagir preferencialmente com os salinos. Desta forma, uma molécula de proteína passa a interagir com outra (interações apolares), devido à falta de moléculas de H2O, formando coágulos que precipitam. Ocorreu turvação nos tubos 5 e 6 após centrifugação, pois, com a adição excessiva de soluçãode sulfato de amônio 60% p/v, houve formação de muitas interações proteína-proteína. Após a retirada do sobrenadante, da adição de PBS e posterior agitação no Vortex, o precipitado ressolubilizou, pois esta não é uma alteração muito brusca na estrutura protéica: apenas priva a proteína de interações com o solvente, e isto pode ser revertido através da retirada do eletrólito da solução.
d. Efeito de Ácidos Fortes (tubos 7 e 8):
A adição de ácidos fortes altera a carga líquida das proteínas, através da mudança dos graus de ionização dos radicais. Isto pode levar a quebra de interações e possivelmente formação de novas. Quanto mais distante da faixa de pH ideal, mais provável que estas alterações sejam irreversíveis. Ao se adicionar ácido sulfúrico 6M às soluções, ambas ficaram turvas, indicando que houve a desnaturação das proteínas. A caseína (solução 8), por formar precipitado antes mesmo da centrifugação, indica que ela é mais sensível ao pH ácido que a ovoalbumina (como previsto na teoria). Ao adicionar PBS aos precipitados e agitá-los no Vortex, nenhum dos dois ressolubilizou, levando à conclusão que a desnaturação alterou a estrutura das duas proteínas de forma irreversível.
e. Efeito de Agentes Caotrópicos (tubos 9 e 10):
A uréia atua na desnaturação protéica alterando os parâmetros do solvente: ela tem mais afinidade pelo estado desnaturado da proteína, pois interage com os radicais hidrofóbicos, que no estado nativo de uma proteína globular, geralmente estão localizados no interior. A acomodação destes resíduos apolares no solvente desloca o equilíbrio para o estado desnaturado, além de diminuir a força hidrofóbica, essencial para a estabilização da estrutura nativa. As soluções de ovoalbumina e caseína se mantiveram inalteradas na presença deste agente desnaturante, indicando que o interior hidrofóbico destas proteínas, em condições normais de temperatura e pressão, não está suscetível à ação da uréia. 
2. DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO
As absorbâncias medidas nos tubos não coincidiram exatamente com a reta esperada para a curva padrão de absorbância da caseína. Estes desvios provavelmente ocorreram, devido a algum erro provocado pelos integrantes do grupo, principalmente durante a transferência das soluções para os tubos de ensaio. Apesar dessa margem de erro, foi possível traçar uma tendência que passou com bastante proximidade entre os quatro pontos marcados no gráfico. É importante notar que as absorbâncias medidas nos tubos de 1 a 5 não são as absorbâncias absolutas da solução, e sim da caseína. A solução de PBS com biureto por si só já absorve certa quantidade de luz, especialmente pelo fato do biureto, em solução aquosa, possuir uma coloração azulada. Logo, para que seja calculada apenas a absorbância da proteína a ser dosada, é medida a absorbância de uma solução composta somente por PBS e biureto (denominado “branco”), e então o valor encontrado é subtraído do valor medido nas soluções contendo caseína. O espectrofotômetro utilizado na prática realiza estes procedimentos automaticamente e fornece diretamente a absorbância da caseína, considerando a presença do PBS e do biureto.
VI. Bibliografia
BERG, Jeremy M.; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L. Biochemistry. 5.ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 2004. 1059p. 
COX, Michael M.; LEHNINGER, Albert Lester; NELSON, David L. Princípios de Bioquímica. 4.ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 1232p. 
GONÇALVES, Joaquim; MOREIRA, Ana Beatriz. Processos de Desnaturação Protéica. 
Disponível em: 
<http://www.scribd.com/doc/15816989/Processos-de-Desnaturacao-Proteica>. 
Acesso em 18/08/2010 às 19h30. 
Proteínas. Disponível em: 
<http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/aminoacido/proteinas10.php>. 
Acesso em 18/08/2010 às 14h30. 
Proteínas. Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/proteinas.htm>. 
Acesso em 19/08/2010 às 17h12. 
CORRÊA, N. C. R.; CUNHA, C. C. da; FONSECA, L. C.; GARROTE-FILHO, M. da S.; PENHA-SILVA, N. Efeito da Composição do Solvente sobre a Estabilidade de Proteínas em Soluções Aquosas. Química Nova. São Paulo, vol. 29, n.º 3, maio/junho de 2006. 
Disponível em: 
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422006000300024&script=sci_arttext>. 
Acesso em 21/08/2010 às 20h14.
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