PRACTICA PRUEBAS BIOQUIMICAS

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Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA - FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS 
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA - CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA 
 
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: 
PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO. 
 
INTRODUCCIÓN 
La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. 
Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la 
comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación 
considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo 
de bacteria y del fin que se persigue en la identificación. Los pasos a seguir para una 
perfecta identificación bacteriana son: 
 
1.- Obtener un cultivo puro 
2.- Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se 
determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es 
importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características 
morfológicas de interés. 
3.- Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los 
métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, 
fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos. 
4.- Realización de pruebas primarias (Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, 
fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y 
movilidad. 
5.- Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas 
dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, 
producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina 
deaminasa, etc.). 
 
Además de los nutrientes básicos y específicos, que le son proporcionados a las especies 
de interés, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la fórmula 
de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos 
con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o 
no, o para distinguir y diferenciar las colonias producidas. 
Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean 
indistintamente productos químicos, principalmente carbohidratos, para conocer su 
capacidad metabólica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos 
para determinar su resistencia, así como a diversos productos biológicos para evidenciar sus 
reacciones. 
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1.- OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA 
a. Entender, comprender y aplicar las técnicas adecuadas para la realización de 
pruebas bioquímicas empleadas rutinariamente en los procedimientos de 
identificación bacteriana. 
b. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta realización de las pruebas 
bioquímicas convencionales en el proceso de identificación bacteriana. 
c. Reconocer la necesidad de emplear cultivos puros como sustrato para la realización 
de pruebas bioquímicas requeridas en el proceso de identificación bacteriana. 
d. Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra, aislamiento y 
proceso de identificación de bacterias realizando las diferentes pruebas bioquímicas 
de uso rutinario en el laboratorio de diagnóstico bacteriológico. 
 
2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR: 
a. Explicación sobre las pruebas bioquímicas de uso rutinario en el diagnóstico 
bacteriológico, los métodos de siembra y sus aplicaciones en el proceso de 
identificación bacteriana. 
b. Demostración de las técnicas de siembra y los pasos a seguir para la correcta 
realización de las pruebas bioquímicas empleadas en diagnóstico bacteriológico 
 
3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS: 
a- Aplicando técnicas asépticas, siembre los diferentes medios de cultivo diferenciales 
líquidos a partir del tubo con el medio de cultivo líquido que se le suministra. Emplee 
el esquema de diseminación del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en 
estufa a 37ºC. 
b- Aplicando técnicas asépticas, siembre el medio de cultivo sólido en tubo (medio con 
bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminación del inoculo indicado. 
Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC. 
 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS: ASPECTOS GENERALES 
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados (las llamadas pruebas bioquímicas 
convencionales), generalmente determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria 
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de 
cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Obviamente, en la identificación 
bacteriana hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, sub-cultivado de una 
colonia bien aislada. Es aconsejable realizar una comprobación efectuando una siembra en 
placa en la que crezcan únicamente colonias del mismo tipo. La identificación de un 
aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de 
características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos 
bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, 
generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones 
químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al 
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crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales 
ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación 
de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un 
valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente 
automatizables. 
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para 
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o 
ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía 
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de 
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo 
bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio 
de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se 
trata de diferentes microorganismos. 
Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la 
fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es 
exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas 
(manuales de identificación, comerciales, etc.). 
HIDRATOS DE CARBONO 
Los carbohidratos comúnmente empleados son diversos. Los más utilizados son los 
monosacáridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, entre otros y los 
disacáridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. También algunos 
trisacáridos, entre los que se encuentra la rafinosa y polisacáridos como la celulosa y el 
almidón. 
Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente de carbono, de 
la composición de diversos medios, para el cultivo primario o las resiembras, así como, 
de los medios bioquímicos destinados para el diagnóstico de las especies. 
El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio, fermenta "in 
vitro" el carbohidrato con formación de sustancias ácidas, como por ejemplo: el ácido 
láctico, lo cual será detectado por la acción del indicador presente en el medio de 
cultivo al variar el pH. 
INDICADORES 
Los indicadores son compuestos químicos elaborados con ácidos o bases débiles, que 
se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la disolución osustancia donde se 
encuentran al variar el pH, debido a su capacidad de ionización mediante la cual, a 
determinado nivel de la escala de pH, transforman los iónes o moléculas y viceversa. 
Los indicadores son de dos colores pudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el 
indicador está cambiado de color, la mitad se encuentra en estado iónico y la otra mitad 
en estado molecular, por lo que el color en esta fase no será definido, sino más bien un 
color intermedio entre ambos. 
Los indicadores que forman parte de la fórmula del medio de cultivo, deben estar en 
concentraciones muy bajas, para que la determinación del pH se deba exclusivamente 
a los cambios que tiene lugar en la solución. 
En el siguiente cuadro se citan ejemplos de indicadores de pH: 
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Cuadro. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH 
I N D I C A D O R 
C O L O R 
RANGO DE pH 
ACIDO BASE 
ROJO FENOL Amarillo Rojo 6.4 - 8.2 
AZUL BROMOTIMOL Amarillo Azul 6.0 - 8.0 
ROJO DE METILO Rojo Amarillo 4.0 - 6.0 
ROJO NEUTRO Rojo Amarillo 7.0 - 8.0 
FENOLFTALEINA Incoloro Rojo 8.0 - 10.0 
ROJO CRESOL Amarillo Rojo púrpura 7.2 - 8.3 
PÚRPURA DE BROMOCRESOL Amarillo Purpura 5.2 - 6.8 
 
Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las 
colonias, en correspondencia con las variaciones del pH. 
SANGRE Y HEMODERIVADOS 
La sangre se emplea en la elaboración de algunos medios de cultivo, no teniendo como 
única finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas 
especies, sino además, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemolítica de 
algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre", 
colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, éstas actúan sobre 
la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolizando a los hematíes total o 
parcialmente. 
Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciará por la 
formación de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis total se 
clasifica como "betha". 
En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hematíes, pero actúa sobre la 
hemoglobina que porta, reduciéndola a biliverdina, el efecto se evidenciará por la 
presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis se 
clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de 
diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son 
utilizadas en diferentes pruebas de hemaglutinación o para detectar diversas 
reacciones hemolíticas. 
El suero sanguíneo se emplea comúnmente para serodiagnósticos y el plasma (sin 
preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimática 
de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma 
sanguíneo, provocando la formación de coágulos. 
COLORANTES 
La edición de determinados colorantes a la fórmula del medio de cultivo, tiene como 
objetivo, inhibir el desarrollo de las especies más sensibles, que interfieren el estudio, 
favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras más resistentes de interés en la 
investigación, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composición 
del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del 
género Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies 
presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan además en este 
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medio con un color, rosado o casi blancas, dependiendo de las condiciones de cultivo y 
el tiempo de incubación. 
Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de Metileno Agar". 
Estos colorantes inhiben el desarrollo de los gérmenes gramnegativos y al mismo 
tiempo permiten diferenciar a las especies de Enterobacterias fermentadoras de 
lactosa, la sacarosa o ambos azúcares, de los que no las fermentan. Por ejemplo, las 
colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris, adquieren un color azul oscuro, con 
aspecto metálico (que se evidencia con luz indirecta), en tanto que las Salmonella spp. 
y las Shigella spp., se mantienen incoloras o ligeramente teñidas, mientras que las del 
resto de los coliformes se tiñen con un tono parduzco. 
PRODUCTOS QUÍMICOS 
Teniendo en cuenta, la información genética de que dispone cada especie bacteriana, 
que la capacita para actuar metabólicamente sobre determinados sustratos, es parcial 
o totalmente diferente entre sí, se emplean para su diagnóstico diversos sustratos, la 
mayoría de naturaleza química, cuyas reacciones específicas, nos aportan información 
acerca de su identidad. 
Entre los productos químicos, empleados con mayor frecuencia se encuentran los 
siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, así como diversos tipos de 
aminoácidos, entre otros. 
El producto químico que se vaya a emplear, formará parte de la fórmula de un medio 
de cultivo, que contiene además los nutrientes necesarios para el desarrollo de la 
especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el producto químico en cuestión, 
generalmente lo degradan por acción enzimática a productos más simples, 
caracterizados por tener un ph diferente al del producto reaccionante, lo cual se pondrá 
en evidencia por la acción del indicador que forma parte del medio de cultivo, que 
proporcionará el cambio de color del medio, haciendo factible la lectura de esa prueba. 
AMINOÁCIDOS 
Los aminoácidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente en el 
laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio, para 
determinar la identidad de la especie. De manera similar a la empleada con los 
productos químicos para igual propósito, cada uno de estos aminoácidos es adicionado 
por separado, en una proporción del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes 
necesarios para el desarrollo del germen y un indicador. 
El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunos microorganismos para 
decarboxilar uno o varios de estos aminoácidos formando una amina con la 
consiguiente alcalinidad, lo que será puesto de manifiesto por la acción del indicador, al 
producirse el cambio de pH. 
ANTIBIÓTICOS 
Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estudio a los 
antibióticos, se realiza una técnica denominada antibiograma con el empleo de discos 
de papel de filtro estériles de unos 5 ó 6 mm de diámetro, impregnados por separado 
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con una carga en g o unidades de un antibiótico determinado, equivalente a la 
concentración sérica media, obtenida en el pico de una terapéutica a dosis habituales. 
Estos discos (desecados) se colocan con todas las precauciones de asepsia sobre la 
superficie del cultivo, tan pronto 
se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurridas 24 horas, un halo 
de inhibición alrededor de cada disco, en dependencia del tamaño del diámetro, será 
indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en estudio a cada uno de 
los antibióticos empleados. 
Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizan pruebas 
específicas con el empleo de un solo disco, impregnado en este caso con bacitracina u 
optoquina. La bacitracina inhibe el crecimiento de más del 95 % de los Estreptococos 
del grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae 
(Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importante dato 
para sus respectivos diagnósticos. 
Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos químicos como: 
el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, así como mediante la exposición delmicroorganismo a sustancias de secreción orgánica como la bilis. La interpretación de 
los resultados se sustentará en el hecho de que los microorganismos sean o no 
capaces de desarrollarse en presencia de estos compuestos. 
 
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1ra SESIÓN PRÁCTICA 
METABOLISMO PROTEICO 
Licuefacción de gelatina (lenta y rápida) 
Fenilalanina desaminasa 
Indol 
Ureasa 
Lisina descarboxilasa 
PRUEBAS DE TOLERANCIA 
BHI con cloruro de sodio al 6,5% 
BHI con pH 9,6 
Bilis esculina 
2da SESIÓN PRÁCTICA 
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 
Oxidación Fermentación de carbohidratos - glucosa 
Hidrólisis de carbohidratos: Medio CTA, Caldo Base Rojo de fenol y/o 
Bromocresol purpura con tubos durhan 
Manitol Movilidad 
Rojo de Metilo 
Voges-Proskauer: Acetoina 
3ra SESIÓN PRÁCTICA 
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 
Kliger 
Hidrólisis de almidón 
ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES 
Catalasa 
Oxidasa 
Reducción de Nitratos 
COMPUESTOS COMO FUENTE ÚNICA DE CARBONO 
Utilización de Citrato 
OTRAS PRUEBAS 
Prueba de cloroformo 
 
 
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METABOLISMO PROTEICO 
 
LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA) 
Detectar la producción de una enzima proteolítica extracelular por parte de las 
bacterias que es la “GELATINASA”. Permite diferenciar géneros productores de 
Gelatinasa, que hidrolizan la Gelatina tales como: 
 
Staphylococcus: (+ muy rápida) 
Bacillus (+) 
Micrococcus: (+ lenta) 
Clostridium (+ lenta) 
Streptococcus - (negativos) 
Listeria - (negativos) 
 
FUNDAMENTO: 
 Gelatinasa(Proteasa) Gelatinasa (Peptidasa) 
Gelatina + Agua Peptonada Polipeptidos aa (Proteina + agua) 
+ bacteria 
 
PROCEDIMIENTO: 
 1) Siembra del m.o. en medio rico en Gelatina por punción profunda 
 Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina 
 Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente) 
 2) Incubar por varios días (20 días) a 20-22ºC 
 3) Colocar en nevera 30’ antes de la interpretación 
 
 
 
RESULTADOS 
 Medio se derrite (líquido) Gelatinasa + (bacteria hidrolizó gelatina) 
 Medio está sólido Gelatinasa - (bacteria no hidrolizó gelatina) 
 
 
PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA) 
 
 
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FENILALANINA DESAMINASA 
 FUNDAMENTO: 
 
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el 
aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de 
fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad 
enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del 
grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras 
enterobacterias 
 
 PROCEDIMIENTO 
 
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del 
bisel con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente 
se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que 
inunde todo el crecimiento. 
 
 
 
 RESULTADO 
 
La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la 
aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado. 
 
 
PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA 
 
 
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PRODUCCIÓN DE INDOL 
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir 
indol a partir del triptófano. 
 
MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO 
 
 Caldo triptonado + Triptona 10,0 g + Cloruro de sodio 5,0 g + agua 
destilada 1000,0 ml 
 pH 7,1 
 
Disuelva los ingredientes, reparta en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 
121°C (15 libras de presión). 
 
Reactivo de Kovac 
Para-dimetil-aminobenzaldehído 10,0 g 
Alcohol amílico o isoamílico 150,0 mL 
Acido clorhídrico concentrado 50,0 mL 
 
Se prepara disolviendo el aldehído en el alcohol y añadiéndole el ácido 
lentamente. Se reparte en pequeñas cantidades y se almacena en el refrigerador 
cuando no esté en uso. 
 
PROCEDIMIENTO 
Se inocula un tubo del medio con el asa de platino, transfiriendo una porción del 
cultivo puro y se incuba a 37°C por 40 a 48 horas. Luego se añaden 0,5 mL del 
reactivo de Kovac y se agita suavemente. 
 
 
 
RESULTADOS 
Una reacción positiva es indicada por la aparición de un anillo rojo en la superficie 
del medio (capa alcohólica). 
 
PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE INDOL 
 
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UREASA 
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para 
hidrolizar la úrea, formando dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima 
ureasa. 
 
MEDIO DE CULTIVO 
 Caldo úrea 
 Extracto de levadura 0,1 g 
 Fosfato monopotásico 9,1 g 
 Fosfato disódico 9,5 g 
 Urea 20,0 g 
 Rojo fenol 0,01 g 
 Agua destilada 1000,00 mL 
 pH 6,7-6,9 
 
Disuelva y esterilice por filtración. 
 
PROCEDIMIENTO 
Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro proveniente de 
un medio sólido. Incube a 37°C por 24 horas. 
 
 
 
RESULTADOS 
Una reacción positiva (hidrólisis de la urea) es indicada por un cambio de color del 
amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o más alcalino). 
 
 
PRUEBA DE UREASA 
 
 
 
 
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DESCARBOXILACIÓN DE LA LISINA 
 
MEDIO DE CULTIVO 
 Caldo Lisina 
 Peptona 5,0 g 
 Extracto de levadura 3,0 g 
 Glucosa 1,0 g 
 Lisina 5,0 g 
 Púrpura de bromocresol 0,02 g 
 Agua destilada 1000,00 mL 
 pH 6,8 
 
Disuelva y caliente a ebullición por 2 ó 3 minutos, reparta en tubos y esterilice en 
el autoclave por 10 minutos a 121°C (15 libras de presión). 
 
PROCEDIMIENTO 
Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro al caldo lisina. Incube 
a 37°C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de 
parafina estéril. 
 
 
 
RESULTADO 
Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace 
virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, 
por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la cual neutralizará el 
ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su color 
original violeta. 
 
 
A tubo sin inocular B resultado positivo C resultado negativo 
 
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PRUEBAS DE TOLERANCIA 
 
BHI CON CLORURO DE SODIO AL 6,5% 
 
Se estudia sembrando el microorganismo en un medio capaz de soportar su desarrollo, 
al cual se le ha agregado NaCl en la concentración referida. El medio puede usarse 
solo, en cuyo caso se lee simplemente por observación de crecimiento o no, o puede 
adicionarse con glucosa al 1% y un indicador de pH, como el rojo fenol, para facilitar la 
lectura. En este último caso, los microorganismos capaces de fermentar la glucosa, y 
tolerar la concentración salina del medio, desarrollan y acidifican, con el consiguiente 
viraje de color en el medio 
 
 
 
RESULTADOS 
 
Crecimiento: Tolera la concentración de sal 
No crecimiento: no tolera la condición 
 
BHI CON pH 9,6 
 
Puede usarse el caldo nutritivo como base, ajustando el pH a 9,6 antes de su 
esterilización. Puede adicionarse glucosa y un Indicador de pH, como se indicó en el 
caso anterior, para facilitar la lectura de resultados 
 
 
 
RESULTADOS 
 
Crecimiento: Tolera el nivel de pH a 9,6 
No crecimiento: no tolera la condición 
 
 
 
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BILIS ESCULINA 
Medio utilizado para el aislamiento e identificación presuntiva de estreptococos del 
grupo D.FUNDAMENTO 
Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e 
hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de 
color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de 
la flora acompañante. 
MEDIO DE CULTIVO 
Fórmula (en gramos por litro) 
 Extracto de carne 3 g Peptona de carne 5 g Bilis de buey 40 g 
 Esculina 1 g Citrato férrico 0.5 g Agar 15 g 
pH final: 6.6 ± 0.2 
 
Suspender 64,5 g en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar 
a ebullición hasta su completa disolución. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar 
15 minutos a 121°C. 
PROCEDIMIENTO 
Sembrar el material en estudio, en tubo o placa según la preferencia. Incubación 
Hasta 3 días a 35-37 °C, en aerobiosis. 
 
 
 
RESULTADOS 
Microorganismos Enterococcus 
faecalis 
ATCC 29212 
Proteus 
mirabilis 
ATCC 43071 
Streptococcus 
pyogenes 
ATCC 19615 
 
Crecimiento Bueno Bueno Inhibido 
Hidrólisis de la 
Esculina 
+ - Inhibido 
Oscurecimiento + - Inhibido 
 
CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO: 
Medio preparado: ámbar u oscuro ligeramente opalescente. El medio con 
esculina tiene un leve tinte azulado. 
 
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METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 
 
OXIDACIÓN FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS – (GLUCOSA) 
 
FUNDAMENTO: 
Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su 
falta de utilización. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e 
hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, 
hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a 
elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los 
microorganismos no fermentadores. El medio posee azul de bromotimol como 
indicador de pH. El test es útil en la diferenciación de los Géneros incluidos en la 
Familia Micrococcaceae como para diferenciar miembros de la Familia 
Enterobacteriaceae de las Pseudomonas. 
 
PROCEDIMIENTO: 
Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato 
por cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de 
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estéril (1,5 a 2 cm de 
alto) para crear condiciones anaerobias. Se incuba a 37°C por 24 horas y hasta 14 
días dependiendo del microorganismo. 
 
Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto el tubo 
aeróbico (sin parafina) como en el anaeróbico, acidifican el medio y provocan el viraje 
del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos sólo 
podrán utilizar el carbohidrato en el tubo aeróbico. Como la producción de ácido en 
algunas especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 días, a 
menos que se observe cambio con anterioridad. 
 
 
INTERPRETACIÓN: 
 
Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo expuesto al O2 
atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su 
color original a amarillo. 
 
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Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos 
tubos viran del verde al amarillo. 
 
Bacterias NO sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino 
después de la incubación, conservando su color original. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
POSITIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS 
 
La mayoría de las bacterias utiliza un cierto número de carbohidratos como fuente 
de energía, ya sea por vía oxidativa, fermentativa o ambas, provocando 
acidificación del medio que se pone de manifiesto por el viraje de un indicados de 
pH incorporado al mismo. Algunas bacterias, producen también gas como 
producto de la fermentación del carbohidrato, lo que es también una característica 
de interés para su identificación. 
 
La investigación de la hidrólisis de distintos carbohidratos se realiza utilizando un 
medio basal como por ejemplo el Cysteina Trypticase Agar (medio o agar CTA), 
que es un medio semisólido, el Caldo Base Rojo de Fenol (rojo en medio neutro o 
alcalino; amarillo en medio ácido), el caldo base Púrpura Bromo Cresol (Violeta en 
medio neutro o alcalino y amarillo en medio ácido), etc. A los medios basales, 
conteniendo un indicador de pH, se añade el azúcar a una concentración final del 
1%. 
 
a.- Medios líquidos: Cuando el medio basal es líquido, se reparte en tubos 
12x120 mm o mayores, dentro de los cuales se introduce un tubo de 
pequeño diámetro o tubo de Durham, en posición invertida. Este tubo se 
llena completamente durante la esterilización, pues por efecto de la 
temperatura y la presión, se desplaza el aire contenido dentro de el. 
 
 Procedimiento: El medio se siembra con el microorganismo en prueba, se 
incuba por 24-48 horas y se procede a la lectura, observando viraje del 
indicador y presencia o no de gas en el tubo Durham. 
 
b.- Medios semisólidos y sólidos: se procede igual, excepto que no requiere 
introducir tubos Durham, pues el gas que se pueda generar queda 
atrapado en el agar y se observa desplazamiento del mismo. 
 
HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (BROMOCRESOL PURPURA CON TUBOS 
DURHAN) 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (CYSTEINA TRYPTICASE AGAR - CTA) 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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MANITOL MOVILIDAD 
 
Se incluyen en este apartado 2 pruebas debido a que pueden realizarse cultivando 
el microorganismo en un único medio (el Manitol Movilidad), que se prepara en 
tubo con agar en taco y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 
horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en medios separados. 
 
Prueba del Manitol: Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar 
el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador 
rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol 
movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las 
enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las 
bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para 
diferenciarStaphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). 
 
Prueba de la Movilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. 
Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran 
principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles. 
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser 
semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las 
bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la 
distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias 
inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron. 
Entre las Enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género 
Klebsiella (-) de las restantes que suelen poseer movilidad (+). Dentro del 
género Bacillus, nos permite diferenciar B. anthracis (-) de otras especies 
generalmente (+). 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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ROJO DE METILO 
FUNDAMENTO: 
La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, 
rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno presentecuando una bacteria cataboliza la glucosa. 
Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido mixta 
sobre los azúcares, ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del 
tipo fórmico, acético, láctico y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad 
de los ácidos orgánicos). 
PROCEDIMIENTO: 
Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), 
cuya composición es la siguiente: 
Peptona 7 g 
Glucosa 5 g 
K2HPO4 5 g 
Agua destilada 1000 ml 
Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de 
ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 
La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica 
al 0,2% (p/v). Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los 
resultados. 
 
RESULTADOS: 
Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá 
rojo el indicador. 
Medio ácido indicador rojo RM (+) (Escherichia coli) 
Medio neutro indicador amarillo naranja. RM (-) (Klebsiella) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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VOGES-PROSKAUER: ACETOINA 
FUNDAMENTO: 
La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína) a 
partir de le fermentación butanodiólica de la glucosa. Las bases bioquímicas de la 
prueba consideran que a partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir vías 
metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la composición de sus 
sistemas enzimáticos. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo 
producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba 
de VP se basa en la detección de este último metabolito. 
La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido 
de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los 
grupos guanidínicos de la arginina, que está presente en las peptonas que 
constituyen el medio, dando una coloración rojiza. 
PROCEDIMIENTO 
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de 
metilo. Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37ºC durante 48 
horas. La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solución de 
KOH al 40% y luego 1 ml de solución alcohólica del alfa naftol al 5% (p/v). Se 
debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja 
en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados. 
 
RESULTADOS (NTERPRETACIÓN) 
La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la 
prueba es positiva. 
 Escherichia coli es VP - 
 Klebsiella sp es VP + 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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KLIGER 
 
FUNDAMENTO: 
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de 
carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico así como la de 
producir gas y ácido sulfhídrico. Se utiliza para identificar diferentes especies 
bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. 
 
MATERIALES: 
- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. 
- tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, pH=7,4. 
 
PROCEDIMIENTO: 
1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por punción y por estría en el 
mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. 
2.- Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. 
3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni después). 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 
La utilización de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos 
ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es 
incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando 
productos que alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta 
prueba deben analizarse los siguientes aspectos: 
 
A) Utilización del hidrato de carbono: 
- Si el microorganismo en estudio sólo fermenta la glucosa: 
a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. 
b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. 
 
- Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la 
lactosa: 
a) en superficie: reacción ácida, color amarillo. 
b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. 
 
- Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la 
lactosa (no entérico): 
a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. 
b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa 
crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reacción 
alcalina, color rojo. 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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- Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de 
oxidarla: 
a) en superficie: reacción ácida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo. 
b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color. 
 
B) Producción de gas: 
Si el microorganismo en estudio es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se 
manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o el desprendimiento 
del medio del fondo del tubo dejando un área clara. 
 
Si el microorganismo en estudio es anaerogénico, no hay producción de gases. 
 
C) Producción de ácido sulfhídrico (SH2): 
Si el microorganismo en estudio produce este ácido, se manifestará por la 
presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del 
tubo. 
 
Si el microorganismo en estudio no produce este ácido, se manifestará por la 
ausencia de dicho precipitado. 
 
 
 
 
1.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (-), Gas (-) 
2.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (-), Gas (-) 
3.- Glucosa (-), Lactosa (-), H2S (-), Gas (-) 
4.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (-), Gas (+) 
5.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (-), Gas (+) 
6.- Glucosa (+), Lactosa (-), H2S (+), Gas (+) 
7.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (+), Gas (+) 
8.- Glucosa (-), Lactosa (-), H2S (+), Gas (-) 
9.- Glucosa (+), Lactosa (+), H2S (+), Gas (+) 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN 
 
Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz 
de hidrolizarel almidón. Esta enzima es muy común en distintos miembros del género 
Bacillus. 
 
MATERIALES: 
- Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. 
- Placas de Petri con agar almidón. 
- Lugol. 
 
PROCEDIMIENTO: 
1.- Sembrar el microorganismo en estudio por estría en una placa con agar 
almidón. 
2.- Incubar a 37 °C hasta observar desarrollo. 
3.- Inundar la placa con lugol. 
4.- Dejar actuar 10 minutos. 
5.- Observar la coloración. 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 
 Prueba positiva: halos de degradación (marrones o transparentes) alrededor de 
las colonias sobre fondo azul. 
 Prueba negativa: ausencia de halos; coloración azul alrededor de las colonias 
(presencia de complejo Iodo-almidón). 
 
 
 
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ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES 
 
CATALASA 
La catalasa es una enzima respiratoria, es una porfirina de hierro cuya funcion es 
desdoblar los peroxidos en H2O y O2. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima 
catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias 
facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. 
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar los géneros: 
 Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). 
 Bacillus (+) de Clostridium (-). 
 Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+)de Erysipelothrix (-) 
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo 
dos técnicas: 
1. Método del portaobjetos (recomendado): 
 Con el asa de siembra recogerel centro de una colonia pura de 18-24 horas y 
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. 
 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el 
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. 
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). 
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. 
 Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua 
oxigenada) pueden producirse falsos positivos. 
 
 
 
 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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2. Método del tubo de ensayo: 
 Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en bisel 
densamente inoculado. 
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). 
 
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se 
debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya 
que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado 
positivo. 
 
 
 
 
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OXIDASA 
 
FUNDAMENTO: 
 
La Prueba de la Oxidasa hace una diferenciación inicial de las bacterias Gram. 
negativas. Se basa en que determinadas bacterias poseen las enzimas citocromo 
oxidasa o indofenol oxidasa, que catalizan el transporte de electrones. En esta 
prueba, un tinte incoloro, como el dihidrocloruro de p-fenilendiamina sirve como un 
aceptor artificial de electrones para la enzima oxidasa. El tinte es oxidado y forma el 
compuesto coloreado, azul de indofenol. 
 
Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, 
Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u 
Aeromonas (+). 
 
MATERIALES: 
- Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. 
- Tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + 
dimetilparafenilendiamina). 
 
PROCEDIMIENTO: 
1.- Levantar con el asa de platino una colonia del cultivo puro. 
2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de 
oxidasa, asegurándose de extender bien el material. 
3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloración. 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 
Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa vira al color 
azul por oxidación de dicho compuesto a azul de indofenol. 
 
Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa 
no se modifica. 
 
A B 
 
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A: oxidasa positivo B: oxidasa negativo 
 
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REDUCCIÓN DE NITRATOS 
 
Se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o en nitrógeno libre. 
Muchos organismos pueden llevar a cabo una reducción no asimiladora del nitrato, que 
actúa como aceptor final de electrones. Este proceso es facultativo y se produce cuando hay 
disponibilidad de oxígeno muy baja o nula. Corresponde a una respiración anaerobia, es un 
proceso de oxidación por el cual las sustancias inorgánicas, especialmente el nitrato que 
proporciona el oxígeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar 
energía. 
La reducción del nitrato da lugar a nitrito como producto final, que a su vez puede ser 
reducido hasta la producción de derivados gaseosos (desnitrificación). 
La presencia de nitritos en el medio de cultivo, originados por la reducción de los nitratos, 
puede detectarse con reactivos adecuados. 
 
El caldo base se debe ajustar a un pH = 7.0. 
 Extracto de carne 3 g 
 Peptona 5 g 
 KNO3 1 g 
 Agua destilada 1 L 
 
Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham 
para detectar producción de gases. Luego se esteriliza el medio a 121ºC durante 20 minutos. 
 
PROCEDIMIENTO: 
Después de inocular los tubos, estos deben ser incubados a 37°C durante al menos 24 
horas y hasta cinco días. Luego se procede a la lectura, observándose en primer lugar la 
presencia o no de gases. Luego se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solución A y 
un ml de solución B, a cada tubo. La aparición de un color rojo intenso indica la presencia de 
nitritos en el medio y por tanto la positividad de la reacción. 
A los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si 
los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloración roja es debido a que en el medio 
existen nitratos; una ausencia de color rojo indicaría que no hay nitratos en el medio (estos 
han sido reducidos inicialmente a nitritos, y después a gas), siendo en este caso la prueba 
considerada como positiva. 
 
Reactivo A: Solución al 0,8% de ácido sulfanílico en ácido acético 5N. 
 Reactivo B: Solución al 0,5% de alfa-naftilamina en ácido acético 5N. 
 
Ambas soluciones se disuelven por calentamiento suave. 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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Esta prueba ayuda a la identificación de Enterobacterias que por lo general reducen los 
nitratos. 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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COMPUESTOS COMO FUENTE ÚNICA DE CARBONO 
 
UTILIZACIÓN DE CITRATO 
Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como 
única fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinización en el medio. 
Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que permite el 
paso del citrato a través de la membrana celular. 
El medio a utilizar para esta prueba es el Kocer Citrato (líquido) o Citrato de Simons (sólido e 
inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales 
minerales, y además un indicador de pH, el azul de bromotimol. 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 
El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el citrato 
ocurre una alcalinización del medio, variando de verde a azul. 
 Color azul en el medio, prueba del citrato + 
 Color verde en el medio, prueba del citrato – 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos para el diagnóstico 
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OTRAS PRUEBAS 
 
PRUEBA DE EXTRACCIÓN DE PIGMENTO CON CLOROFORMO 
 
Esta prueba bioquímica permite investigar los pigmentos producido por cepas de 
Pseudomonas. 
 
MATERIALES: 
- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. 
- tubos con caldo nutritivo. 
- cloroformo 
 
PROCEDIMIENTO: 
1.- Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo. 
2.- Incubar a 37 °C. 
3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. 
4.- Observar los resultados. 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 
Prueba positiva: La fase clorofórmica toma color azul verdoso por extracción de 
piocianina. 
Prueba negativa: La fase clorofórmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento).