MICROSCOPIA

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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA 
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS 
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA 
CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA 
ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA 
 
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL: PRÁCTICA Nº 3 
MICROSCOPIA. OBSERVACIONES MICROSCOPICAS EN FRESCO O 
MONTAJE HUMEDO. COLORACIONES SIMPLES 
 
MICROSCOPIA 
El microscopio es un instrumento óptico diseñado para amplificar las imágenes 
visuales de objetos pequeños, que ha jugado un papel indispensable en el estudio de 
los microorganismos, debido a las limitaciones del ojo humano como instrumento 
amplificador. El tamaño aparente de un objeto, observado por el ojo humano, está 
directamente relacionado con el ángulo que el objeto forma con el ojo; de ahí que si 
se reduce a la mitad su distancia alojo, se duplica su tamaño aparente. Sin embargo 
el ojo no puede enfocar los objetos situados a menos de 25 cm. aproximadamente, 
distancia esta que se corresponde con la de máxima amplificación efectiva del ojo. 
Para poder ser visto, un objeto debe formar con el ojo un ángulo de 10 o mayor. Para 
una distancia de 25 cm., esto corresponde a una partícula con un diámetro de 0,1 
mm. 
 
Fig. N° 1: Tipos de Microscopios 
La función de los sistemas de lentes amplificadoras del microscopio compuesto 
consiste, en gran parte, en aumentar el ángulo aparente que forman con el ojo, los 
objetos que están en el campo microscópico. 
Además de la amplificación, son de gran importancia otros dos factores: el 
contraste y la resolución. Para poder ser percibido a través del microscopio, un objeto 
debe poseer un cierto grado de contraste con el medio que lo circunda; con el fin de 
producir una imagen amplificada clara, el microscopio debe poseer un poder 
resolutivo suficiente como para permitir la percepción, como objetos separados, de 
dos puntos adyacentes muy próximos entre sí. 
 
 
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EL MICROSCOPIO OPTICO 
Los microscopios compuestos constan de tres sistemas de lentes: 
a) El Condensador, interpuesto entre la fuente de luz y la muestra, rectifica los 
rayos de luz en el piano del campo microscópico. b) El Objetivo produce una imagen 
ampliada del campo microscópico dentro del microscopio y c) el Ocular amplia aun 
más esta imagen y permite su percepción por el ojo humano. 
Los lentes tienen dos defectos ópticos inherentes: 
1.- Aberración esférica: No logran enfocar simultáneamente todo el campo del 
microscopio. 
2.- Aberración cromática: Producen irisaciones en tomo a los objetos que 
están en el campo microscópico. 
Estos defectos pueden eliminarse colocando lentes correctores adicionales, 
adyacentes a una lente amplificadora primaria. Por eso, tanto las lentes objetivos 
como los oculares son múltiples y han sido diseñadas para reducir al mínimo estas 
aberraciones. 
El ajuste correcto del condensador es de mucha importancia para proporcionar 
una imagen clara. Cuando se utiliza un microscopio de muchos aumentos, el lente 
condensador debe colocarse de manera que proporcione una iluminación crítica del 
campo microscópico. Los rayos procedentes de la fuente luminosa deben enfocarse 
en el plano de observación y el campo de luz transmitida debe llenar casi 
completamente el lente objetivo. 
PODER RESOLUTIVO: 
Las propiedades físicas de la luz establecen un límite fijo a la amplificación 
efectiva que es posible obtener con un microscopio óptico. Debido a la naturaleza 
ondulatoria de la luz, un objeto muy pequeño aparece como un disco rodeado de una 
serie de anillos luminosos y oscuros. Dos puntos adyacentes pueden distinguirse 
como separados o resueltos, solamente si los anillos que los rodean no se 
superponen. La distancia entre dos puntos que pueden distinguirse entre sí se conoce 
como limite de resolución y determina la máxima amplificación útil del microscopio. Él 
limite de resolución esta definido por la ecuación: 
 
 
Donde: 
D = Poder resolutivo 
 = Longitud de onda de la luz usada 
N = índice de refracción del medio entre la muestra y el objetivo. 
 = mitad del ángulo formado por la muestra y el objetivo. 
 0,5  
D= 
 N seno  
 
 
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Los términos del denominador, comúnmente conocidos como apertura 
numérica, describen las propiedades de la lente objetivo. Hasta un cierto limite, el 
aumento de la apertura numérica Incrementa el poder de resolución. Si el medio que 
hay entre la muestra y el -objetivo es el aire, el posible diámetro de la lente objetivo 
limita la apertura numérica a 0,65 aproximadamente. El valor de N puede 
incrementarse llenando el espacio intermedio con aceite, que tiene un índice de 
refracción mas elevado que el aire. Con lentes de inmersión en aceite la Apertura 
numérica puede incrementarse hasta 1,4 aunque los de 1,25 son los más comunes. 
Bajo condiciones ideales, la resolución máxima que puede obtenerse con un 
microscopio óptico se aproxima a los 200 nm, con luz visible de onda más corta (425 
nm). En otras palabras, dos puntos que estén e una distancia menor de 200 nm no 
podrán resolverse como imágenes separadas. 
EL CONTRASTE: MÉTODOS PARA INCREMENTAR SU VALOR: 
Cuando un pequeño objeto biológico tal como una bacteria se observa en 
estado vivo, esta normalmente suspendida en un medio acuoso, comprimida en una 
fina capa de liquido entre lamine y laminilla. La percepción de tal objeto depende del 
grado de contraste que tenga con el medio acuoso circundante, como resultado de 
que a través de él se trasmite menos luz que a través del medio que lo rodea. Esta 
reducción en la transmisión de luz a través del objeto viene dada en parte, por la 
absorción de luz por la célula y principalmente, por la refracción que sufren los rayos 
de luz fuera del paso óptico del microscopio. 
 
Fig. N° 1: Microscopia de examen al fresco 
 
 
1.- TINCIÓN: 
El grado de contraste que ofrece una bacteria puede ser grandemente 
aumentado por procedimiento de tinción. La mayoría de los procedimientos de tinción 
 
 
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matan a la célula y además, como paso previo e la tinción, las células o bacterias 
generalmente se fijan mediante tratamiento químico o calórico. 
Generalmente no es necesario teñir las células microbianas para hacerlas 
visibles; la forma mas sencilla y muchas veces la más satisfactoria de observar 
microorganismos es en estado vivo, en las llamadas preparaciones en fresco o 
húmedas. 
Las coloraciones permiten aumentar el contraste ofrecido por el 
microorganismo y facilita el estudio de la morfología, tamaño, formas de agrupación y 
además, y fundamentalmente, proporcionan información valiosa en cuanto a la 
estructura interna y propiedades químicas de la célula. Así, los métodos de tinción 
específicos para ácido desoxirribonucléico pueden revelar la estructura y localización 
del material nuclear; ciertos métodos de tinción especiales permiten demostrar la 
presencia de depósitos intracelulares de sustancias de reserva tales como glucógeno, 
almidón, poli-metafosfatos, poli -hidroxibutirato, etc. La tinción de Gram y la tinción 
para organismos ácido-alcohol-resistentes suministran información útil acerca de la 
estructura y composición química de la pared celular bacteriana. Las técnicas de 
tinción negativa, con uso de sustancias que no penetran al interior de las células 
permiten revelar la presencia de capas superficiales compuestas por material poco 
denso, tales como cápsulas y capas mucosas. 
2.- MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES: 
El contraste puede aumentarse grandemente mediante el uso del microscopio 
de contraste de fases, basados en el hecho de que la velocidad a la que se desplaza 
la luz a través de los objetos está en relación inversa a sus índices de refracción. 
Como la longitud de onda de la luz es independiente del medio a través del cual viaja, 
la fase de un rayo de luz que pasa a través de un objeto con índice de refracción 
superior al del medio que lo circunda, será retrasada relativamente. Un sistema de 
anillos en el condensador y en el objetivo separa los rayos refractadospor la muestra, 
de aquellos que no lo son; los dos conjuntos de rayos se recombinan después de que 
los refractados hayan pasado por un cristal que introduce una diferencia de fase 
adicional. Mediante estas modificaciones ópticas, el grado de contraste de las células 
o de las estructuras intracelulares cuyos índices de refracción difieren ligeramente del 
índice de refracción del medio circundante, se aumenta considerablemente, 
facilitándose así su observación. 
 
 
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3.- MICROSCOPIO DE FONDO O CAMPO OSCURO 
Algunos microorganismos tales como los treponemas y las leptospiras se tiñen 
mal o no lo hacen con las técnicas de tinción ordinarias y son además, poco 
retráctiles, por lo que no pueden observarse en preparaciones no teñidas. Sin 
embargo, es posible visualizar este tipo de microorganismos mediante el uso del 
microscopio de fondo oscuro. 
En el microscopio de fondo o campo oscuro la trayectoria usual de la luz queda 
bloqueada por un disco convexo ubicado en el condensador especial. La luz oblicua 
que ordinariamente no entra al objetivo, es refractada por el objeto y, en 
consecuencia, este aparecerá luminoso y visible sobre el fondo oscuro. La técnica 
permite detectar objetos muy pequeños o traslúcidos, de difícil observación por otros 
métodos. 
 
4.- MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA 
Ciertas tinturas o colorantes absorben energía luminosa de una longitud de 
onda y emiten luz de otra longitud de onda. Estos colorantes se denominan 
fluorocromos. Ejemplo de estas sustancias fluorescentes o fluorocromos son la 
auramina, la rodamina y el isotiocianato de fluoresceína (FITC). 
 
 
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Cuando un objeto fluorescente o teñido con fluorocromos es irradiado con luz 
ultravioleta o azul, emitirá luz de longitud de onda más larga y se observará 
brillantemente coloreado sobre un fondo negro. 
 
El principal uso del microscopio de fluorescencia está representado por la 
técnica de inmunofluorescencia. Cuando un animal es inoculado con un antígeno 
específico (Ej. un tipo de bacteria) se produce una respuesta muy compleja 
(respuesta inmunológica) y como producto de esta respuesta aparecen en el suero 
del animal unas proteínas especiales, del tipo de las globulinas, denominadas 
anticuerpos. Un anticuerpo es capaz de unirse específicamente con el antígeno que 
indujo su aparición. Los anticuerpos pueden conjugarse a sustancias fluorescentes 
como el isotiocianato de fluoresceína o la rodamina, en cuyo caso hablamos de 
anticuerpos marcados con el fluorocromo. Un anticuerpo marcado con el fluorocromo 
puede unirse específicamente al antígeno correspondiente, previamente fijado a una 
lámina portaobjeto, formándose un complejo antígeno-anticuerpo-fluorocromo, capaz 
de emitir fluorescencia al ser irradiado con luz ultravioleta. Este método se ha aplicado 
y sigue usándose para detectar virus rábico en muestras de cerebro, Streptococcus 
pyogenes en exudados faríngeos, Escherichia coli en heces, Clostridium perfringens, 
Clostridium tetani, por citar sólo algunas de las aplicaciones más comunes. 
 
MANEJO DEL MICROSCOPIO 
Para una buena observación microscópica es necesario reunir dos condiciones 
esenciales: Iluminación conveniente y enfoque perfecto. 
La iluminación sea natural o artificial debe ser adecuada tanto en calidad como 
en cantidad. En general, mientras mayor es el aumento mayor será la cantidad de 
luz necesaria. 
Es recomendable comenzar la observación usando el objetivo de menor 
aumento para facilitar el enfoque de la preparación; para ello, se coloca el objetivo 
10X lo más cerca posible del portaobjeto o lámina y posteriormente, usando el tomillo 
macrométrico, se desplaza el tubo óptico hacia arriba, mientras se mira a través del 
 
 
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ocular, hasta lograr la visualización de la preparación; el ajuste del foco se logra 
manipulando el tomillo micrométrico. 
Una vez enfocada la preparación a bajo aumento, se le hace girar el revolver 
del microscopio y se coloca el objetivo de 40X (o cualquier otro que se desee o 
requiera usar) y se ajusta el enfoque con el micrométrico. Los objetivos 10X, 25X, 
40X, 45X etc., son los llamados objetivos secos, usados para examinar 
preparaciones húmedas entre lámina y laminilla y, ocasionalmente, ciertas 
preparaciones coloreadas. Cuando se requieran aumentos superiores a los 
proporcionados por los objetivos secos, se recurre a los llamados objetivos de 
inmersión (100X), para cuyo uso se requiere colocar una gota de aceite de inmersión 
sobre la preparación a examinar, con el fin de evitar que el aire se interponga entre la 
preparación y el sistema óptico. 
En Microbiología, todas las preparaciones teñidas se examinan usando 
objetivo de inmersión. Debemos señalar que debido a la pequeña distancia que 
separa al objetivo de la preparación, se debe tener especial cuidado al enfocar o al 
afinar el enfoque para evitar daños irreparables en la preparación o, lo que es más 
importante, en el objetivo. Se recomienda descender el objetivo con cuidado hasta de 
prácticamente toque la preparación observando por fuera para evitar daños o 
rupturas; posteriormente, observando a través del ocular retirar muy lentamente el 
objetivo de la preparación hasta visualizar el campo y luego afinar el enfoque con el 
micrométrico. 
Además de las recomendaciones antes anotadas recuerde: 
a) Examine el microscopio que se le suministra y reporte cualquier irregularidad 
antes de iniciar su trabajo. 
b) Cuando se examinan preparaciones húmedas o en fresco se debe mantener 
la platina horizontal 
c) Cuando se observan preparaciones teñidas, se recomienda mantener el 
condensador en la posición más elevada y si fuese necesario, disminuir la 
cantidad de luz cerrando el diafragma iris. Si se trata de preparaciones 
húmedas el exceso de luz puede impedir la visualización, por lo que el 
condensador debe bajarse un poco y probablemente se requiera cerrar 
bastante el diafragma iris. 
d) Adopte una postura correcta durante los períodos de observación. 
e) Mantener ambos ojos abiertos para evitar el cansancio visual 
f) Retire las láminas del microscopio y deséchelas en el envase destinado a tal 
fin. 
g) Limpie el objetivo y el ocular al finalizar su trabajo 
h) Cuando traslade el microscopio sosténgalo con ambas manos: una en el asa 
y otra en la base del microscopio. 
i) Entregue el microscopio al personal técnico responsable 
 
 
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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO 
 
Partes de un microscopio 
óptico 
 
 
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PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO 
SISTEMA ÓPTICO 
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del 
objetivo. 
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. 
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la 
preparación. 
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. 
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. 
 
SISTEMA MECÁNICO 
SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. 
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. 
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o 
binocular. 
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, 
cambiar los objetivos. 
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y 
micrométrico que consigue el enfoque correcto. 
 
 
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MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la 
platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso 
anterior, ya debería estar en esas condiciones. 
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o 
colocar el de 10 aumentos (10X) si la preparación es de bacterias. 
Para realizar el enfoque: 
4. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el 
tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamentey no a través 
del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación 
pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. 
5. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el 
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo 
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 
6. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y 
suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el 
enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es 
 
 
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preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación 
desde el paso “3”. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la 
preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: 
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y 
mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se 
enfocó con el objetivo de inmersión. 
Empleo del objetivo de inmersión: 
7. Bajar totalmente la platina. 
8. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que 
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. 
9. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino 
entre éste y el de x40. 
10. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. 
11. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de 
inmersión. 
12. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la 
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota 
ascendiera y se adosara a la lente. 
13. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre 
el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que 
con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 
14. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se 
puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de 
aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y 
repetir la operación desde el paso “3”. 
15. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se 
coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento 
ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el 
objetivo de inmersión en posición de observación. 
16. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel 
especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está 
perfectamente limpio. 
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en 
posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no 
sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su 
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de 
 
 
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forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para 
protegerlo del polvo. 
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy 
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el 
microscopio. 
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en 
el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos 
recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo 
sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el 
objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No 
hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes 
en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, 
micrométrico, platina, revólver y condensador). 
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a 
la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar 
nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está 
observando a través del ocular. 
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún 
líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño 
humedecido en xilol. 
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión 
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general 
de los mismos. 
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS 
Para la caracterización de una bacteria, los detalles morfológicos y tintoriales 
específicos generalmente se estudian mediante el microscopio óptico corriente. 
Muchas de las técnicas aplicadas para el estudio microscópico de las bacterias 
son clásicas y se han mantenido a través de los años por la utilidad de la información 
que pueden aportar. Sin embargo, debemos señalar que es importante comprender 
las limitaciones inherentes a tales técnicas. Siempre que se desee identificar una 
determinada bacteria se requieren los datos relativos a forma, tamaño, motilidad, 
reacción tintorial al Gram, etc. Pero estos datos usualmente no son suficientes para 
lograr la identificación. Además, muchos fracasos en la identificación de un aislado se 
deben a errores la apreciación de la forma, interpretación de la motilidad, técnica de 
tinción mal aplicada o interpretada, etc. 
Además, generalmente no es sencillo observar bacterias en su hábitat natural 
por cuanto no siempre se encuentran en grandes cantidades, el material en el que se 
encuentran puede entorpecer su visualización, pueden encontrarse mezcladas con 
otros microorganismos morfológicamente similares. 
 
 
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La observación microscópica de los microorganismos puede lograrse mediante 
dos tipos de técnicas: 
1.- Observación directa en fresco 
2.- Observación previa tinción. 
OBSERVACIONES MICROSCOPICAS EN FRESCO O MONTAJE HUMEDO 
Las preparaciones húmedas y en gota pendiente permiten visualizar 
microorganismos suspendidos en un líquido, en condiciones de vida normal y el 
estudio de la forma, motilidad, tropismos particulares y proceso de división celular. El 
examen directo o en fresco entre lámina y laminilla se prepara de la siguiente 
manera: 
EXAMEN DIRECTO O EN FRESCO: 
a. Tome una lámina porta-objeto limpia y desgrasada. 
b. Respetando las técnicas de asepsia, coloque en el centro de la lámina una 
gota de la suspensión a examinar (3 o cuatro asadas son suficientes). 
Recuerde quemar el asa antes y después de cada toma de material. 
c. Tome una laminilla cubre-objeto y manteniéndola ligeramente inclinada 
colóquela en el borde de la gota a fin de que por capilaridad la gota corra a 
lo largo del borde de la laminilla. (Ver dibujo) 
d. Deje caer la laminilla cuidadosamente sobre la lámina, cubriendo la gota de 
líquido. De esta manera se disminuye la posibilidad de atrapar burbujas de 
aire que crean corrientes y dificultan la observación. 
e. Monte la lámina en la platina del microscopio, manteniendo la platina en 
posición horizontal y proceda a enfocar con objetivo 10X. 
 
GOTA PENDIENTE 
Para las preparaciones en gota pendiente se procede así: 
 
 
 
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a. Tome una lámina excavada (de Koch) limpia y desgrasada. Coloque una fina 
capa de vaselina alrededor de la excavación. 
b. Tome una laminilla cubre-objeto limpia y desgrasada. 
c. Respetando las técnicas de asepsia, coloque en el centro de la laminilla una 
gota de la suspensión a examinar. 
d. Tome la lámina excavada y colóquela invertida sobre el cubre objeto, 
cuidando que la gota de líquido quede en la zona de la excavación. Presione 
la lámina suavemente para que la vaselina selle y adhiera la laminilla. 
e. Volteé el conjunto de lámina y laminilla y monte en el microscopio.f. Dado que las bacterias en suspensiones acuosas tienen propiedades ópticas 
similares a las del agua, son difíciles de observar en las preparaciones 
húmedas, por lo que resulta recomendable disminuir la iluminación para 
incrementar el contraste. Esto puede lograrse bajando el condensador o 
cerrando el diafragma iris. 
Las técnicas de observación en fresco son las únicas que permiten la 
observación de la forma de los microorganismos sin las alteraciones que introducen 
las técnicas de fijación y tinción. En ocasiones es necesario recurrir al uso del 
microscopio de fondo oscuro, de contraste de fase, o a tinciones negativas a fin de 
evidenciar bacterias particularmente sutiles como las leptospiras y treponemas. 
OBSERVACIONES MICROSCOPICAS PREVIA TINCIÓN 
Aunque los montajes en fresco o húmedos pueden aportar mucha información 
valiosa, tienen limitaciones importantes; Las bacterias en suspensión se agitan sea 
por movimiento browniano o por verdadera motilidad y es difícil en esas 
circunstancias apreciar con claridad las características morfológicas. Además, su 
pequeño tamaño y poca densidad dificultan aún más el estudio detallado de sus 
características. De manera que se han desarrollado métodos para inmovilizarlas, 
fijarlas (evitando la agitación por movimiento browniano o por motilidad propiamente 
dicha) y luego teñirlas con un colorante. 
FIJADORES y FIJACIÓN: 
 
 
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El propósito de la fijación es preservar los microorganismos y evitar que el frotis 
o extendido sea arrastrado durante la coloración. Los extendidos pueden fijarse por 
calor, alcohol y ocasionalmente, otros químicos. 
FIJACIÓN POR CALOR: 
a. Es el método más ampliamente usado por su facilidad y economía. Sin 
embargo debemos señalar que este método puede dañar a los 
microorganismos y alterar sus propiedades tintoriales, sobre todo 
cuando el calor aplicado es excesivo. Se recomienda realizar la fijación 
por calor de la siguiente manera: 
b. Preparar extendidos sobre láminas limpias, secas y desgrasadas 
c. Dejar secar al aire. 
d. Pasar rápidamente el extendido seco por la llama del mechero tres 
veces, sin sobrecalentar. Después de cada pase, coloque la lámina 
sobre el dorso de la mano; no debe sentirse molestia por calor excesivo. 
FIJACIÓN CON ALCOHOL: 
a. Preparar extendidos sobre láminas limpias, secas y desgrasadas 
b. Dejar secar al aire. 
c. Cubrir el extendido con dos o tres gotas de alcohol o metanol absoluto 
d. Dejar actuar por un mínimo de 2 minutos o hasta que se seque el 
alcohol. 
COLORANTES Y COLORACIÓN: 
Los mejores colorantes para las bacterias son los colorantes de anilina 
(colorantes orgánicos sintéticos derivados del nitrobenceno que se obtiene del 
alquitrán de hulla). Un ejemplo de colorante natural es la hematoxilina. Usando estos 
colorantes directamente sobre extendidos o frotis previamente fijados, es posible 
visualizar claramente el contorno del cuerpo bacteriano. 
Químicamente los colorantes son sales. Pueden ser básicos, ácidos o neutros 
dependiendo de que el componente colorante este contenido en la parte básica o 
ácida del colorante, o en ambas. 
COLORANTES BÁSICOS: 
El colorante está contenido en la parte básica y la parte ácida carece de color. 
La mayoría de los colorantes usados en bacteriológica son básicos; ejemplo de ellos 
son el cristal violeta, la fucsina y el azul de metileno. 
COLORANTES ÁCIDOS: 
El colorante está contenido en la parte ácida y la parte básica carece de color. 
Muy pocos colorantes ácidos son de utilidad en microbiología, excepto para proveer 
un contraste o fondo. Un ejemplo de este tipo de colorantes es la eosina. 
COLORANTES NEUTROS: 
 
 
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Ambas partes (ácida y básica) del colorante presentan color. Generalmente se 
forman del precipitado que se produce al mezclar colorantes ácidos y básicos. Un 
ejemplo de colorante neutro es el Giemsa. 
Note que los términos ácido, básico y neutro se usan en este caso para 
designar al radical coloreado de la molécula del colorante y no al pH de la 
solución colorante. 
En ocasiones, un microorganismo o tejido puede ser teñido sólo cuando se usa 
un químico antes, durante o después de la aplicación del colorante. En estos casos el 
químico utilizado para lograr la tinción recibe el nombre de mordiente. La forma de 
acción de muchos mordientes no está claramente dilucidada. Los mordientes ácidos 
reaccionan con colorantes básicos y los mordientes básicos lo hacen con los 
colorantes ácidos. 
Algunos ejemplos de mordientes están dados por el fenol en la solución de 
carbol fucsina utilizada en la coloración de Ziehl-Neelsen para bacterias ácido alcohol 
resistentes; el Lugol o solución de lodo-ioduro de potasio usada después de la 
aplicación del cristal violeta en la coloración de Gram. 
Las preparaciones coloreadas, cuando se realizan adecuadamente, permiten 
observar claramente la morfología, medir el tamaño de las bacterias, clasificarlas por 
su forman tipo de agrupación. Dependiendo del tipo de coloración aplicada es posible 
obtener información adicional. 
Las bacterias son tan pequeñas que su tamaño se expresa en micrómetros 
(m) Un micrómetro es la millonésima parte de un metro, la milésima parte de un 
milímetro y la diezmilésima parte de un centímetro. Tanto la longitud como el diámetro 
varían de una especie bacteriana a otra; las más pequeñas pueden presentar 
tamaños de 0,5 m m x 0,5 a 1 m, mientras que las grandes bacterias filamentosas 
pueden medir hasta 100 m de largo. La mayoría de las bacterias patógenas 
presentan diámetros de 0,5 a 1,0 m x 1-5 m de longitud. 
 
LOS PASOS FUNDAMENTALES PARA OBTENER PREPARACIONES TEÑIDAS 
SON: 
1.- Confección de frotis o extendidos. 
2.- Fijación del frotis o extendido. 
3.- Tinción propiamente dicha. 
 
CONFECCIÓN DE FROTIS O EXTENDIDOS: 
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una 
muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si 
aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y 
nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder 
aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio 
 
 
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de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La 
fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y 
adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las 
posibles agrupaciones de células que pudiera haber. En microbiología los frotis 
bacterianos se pueden elaborar a partir de medios líquidos y de medios sólidos. 
a) A PARTIR DE SUSPENSIONES O MEDIOS LÍQUIDOS: 
1. Tome una lámina porta-objeto limpia y desgrasada. 
2. Con su marcador, trace un circulo de aproximadamente 2 cm de 
diámetro en la parte central de la lámina. Marque la lámina. 
3. Volteé la lámina y colóquela sobre el mesón son el lado no marcado 
hacia arriba. 
4. Respetando las técnicas de asepsia y usando asa de platino, tome un 
asa de la suspensión o medio y colóquela en el centro del círculo 
trazado. Disemine suavemente el material para cubrir el área del círculo. 
La película del frotis debe ser fina y homogénea. 
5. DEJE SECAR AL AIRE 
6. Una vez seco, fije el frotis pasando la lámina rápidamente por la llama 
del mechero, tres veces. NO SOBRECALIENTE. 
7. Dejar enfriar completamente el frotis. 
b) A PARTIR DE MATERIALES O MEDIOS SÓLIDOS: 
1. Repetir los pasos 1, 2 Y 3 
2. Deposite una gota de solución salina fisiológica (0,85% de NaCI en agua 
destilada) estéril en el centro del círculo. 
3. Respetando las técnicas de asepsia y usando asa o aguja, tome una 
muy pequeña cantidad del material sólido o cultivo en medio sólido y 
suspéndalo homogéneamente en la solución salina, mediante 
movimientos suaves; disemine delicadamente el material en el área del 
círculo. El frotis debe quedar fino y homogéneo. Es frecuente el error de 
tomar mucha cantidad de medio sólidodando lugar a frotis muy gruesos, 
que no permiten la observación. 
4. DEJE SECAR AL AIRE 
5. Una vez seco, fije el frotis pasando la lámina rápidamente por la llama 
del mechero, tres veces. NO SOBRECALlENTE. 
6. Dejar enfriar completamente el frotis