Na metodologia de coloração de Gram, a sequência estabelecida por Gram para a aplicação dos corantes é a seguinte: cristal violeta, lugol, álcool-acetona e safranina. Essa sequência permite diferenciar bactérias Gram-positivas, que retêm o corante violeta, das bactérias Gram-negativas, que perdem o corante violeta durante a etapa de descoloração com álcool-acetona. Ao modificar a sequência de aplicação dos corantes, podem ocorrer diferentes resultados. Por exemplo, se invertermos a sequência e aplicarmos a safranina antes do cristal violeta, todas as bactérias seriam coradas de rosa, dificultando a distinção entre Gram-positivas e Gram-negativas. Da mesma forma, se excluirmos a etapa de descoloração com álcool-acetona, todas as bactérias seriam coradas de violeta, independentemente de serem Gram-positivas ou Gram-negativas. Portanto, alterações na sequência de aplicação dos corantes podem levar a resultados imprecisos ou dificultar a distinção entre os tipos de bactérias. É importante seguir a sequência estabelecida por Gram para obter resultados confiáveis na coloração de Gram.
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