Coloração de Gram (3)

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Universidade Federal do Recôncavo da Bahia 
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas 
Microbiologia 
Professora: Talita Honorato 
 
 
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MICROSCOPIA – COLORAÇÃO DE GRAM 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
 
Quando observados em um microscópio óptico a maioria dos micro-organismos parece quase 
incolor, por isso devemos prepará-los para observação. A coloração é uma das formas pelas quais isso pode 
ser feito. Basicamente, existem corantes simples e corantes específicos que são utilizados para distinguir 
diferentes tipos de material, como lipídeos, carboidratos e proteínas, ou associações de diferentes materiais. 
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2005; VERMELHO et al, 2006). 
 
COLORAÇÕES 
SIMPLES DIFERENCIAL 
Positiva Separação de Grupos Visualização de Estruturas 
Negativa Coloração de Gram Esporos 
 Coloração de Ziehl – Neelsen Cápsulas 
 Flagelo 
Quadro 1: Tipos de colorações utilizadas em microscopia óptica. 
 
Os corantes são classificados de acordo com a carga do íon da porção corante da molécula. Assim, 
os corantes ácidos têm uma carga negativa; e os básicos têm carga positiva. Normalmente os corantes básicos 
são os mais empregados. Isso se justifica pelo fato de o íon positivo colorido em um corante básico ser atraído 
pela célula bacteriana carregada negativamente. (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; TORTORA; 
FUNKE; CASE, 2005). 
 
CORANTES BÁSICOS CORANTES ÁCIDOS 
Violeta de genciana Eosina 
Azul de metileno Fucsina ácida 
Verde malaquita Nigrosina 
Safranina 
Quadro 2: Exemplos de corantes básicos e ácidos. 
 
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A coloração simples utiliza apenas um único corante básico. Ela pode ser positiva, quando é baseada 
na utilização de corantes carregados positivamente. E negativa, nesse caso o corante é acídico e repelido pela 
carga negativa da célula. A lâmina de vidro fica corada enquanto o micro-organismo aparecerá mais claro, 
transmitindo a idéia de um negativo fotográfico. (VERMELHO et al, 2006). 
Diferente da coloração simples, na coloração diferencial é empregado dois corantes contrastantes, 
que reagem de modo distinto com tipos diferentes de bactérias, sendo possível diferenciá-las. Os mais 
freqüentes são a coloração de Gram e a coloração álcool-ácido resistente (Ziehl-Neelsen). (TORTORA; 
FUNKE; CASE, 2005). 
A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês 
Hans Christian Joachim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriam cores diferentes 
quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficam 
roxas, chamadas de gram-positivas, e as que ficam vermelhas, chamadas de gram-negativas. (MARTINS et 
al, 2001). 
As bactérias gram-positivas retêm o pigmento do corante cristal de violeta ou violeta de genciana, 
uma vez que ocorre a formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (Lugol), mesmo depois da 
lavagem com álcool, que desidrata a parede celular e diminui a porosidade e a permeabilidade. As bactérias 
gram-negativas não retêm o pigmento do cristal de violeta, apesar de ser corado por ele. O álcool dissolve a 
sua membrana externa, deixando pequenos furos na delgada camada de peptideoglicana, promovendo a saída 
dos cristais de violeta-iodo. Assim, o álcool promove a remoção do pigmento azul ou violeta desse corante, 
tornando essas bactérias incolores. Com a adição do contra-corante (safranina ou fucsina), as células das gram-
negativas tornam-se rosas ou vermelhas e as gram-positivas não são afetadas, permanecendo azuis ou violetas. 
(MARTINS; CARVALHO, 2008). 
 
OBJETIVOS 
Conhecer e diferenciar os tipos de coloração. 
Discutir a importância do método de Gram na identificação de micro-organismos. 
 
MATERIAL 
 
• Lâminas e lamínulas limpas 
• Pinça 
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• Alça de inoculação 
• Lamparina 
• Microscópio óptico 
• Pipeta Pasteur 
• Culturas microbianas 
• Solução salina fisiológica 0,85% estéril 
• Cristal violeta, lugol (solução iodo-iodeto), álcool 95% e fucsina 
• Papel absorvente 
• Óleo de imersão 
 
PROCEDIMENTOS 
Precedendo a coloração propriamente dita, é necessária a confecção de lâminas com os micro-
organismos a serem analisados. 
As lâminas de vidro devem ser lavadas com água e sabão, enxaguadas exaustivamente em água e 
deixadas em um recipiente com etanol (álcool) a 95%. Antes da utilização devem ser retiradas do recipiente 
com uma pinça e secas com papel-toalha ou pano bem macio que não solte fiapos. (VERMELHO et al, 2006). 
O preparo do esfregaço obedece aos seguintes procedimentos: 
 
Preparo do esfregaço 
 
• Micro-organismos em meio líquido: 
- Com o auxílio de uma pinça, tomar uma lâmina de microscopia imersa em álcool; 
- Flambá-la na chama de um bico de Bunsen ou lamparina; 
- Deixar que a lâmina esfrie a temperatura ambiente; 
- Flambar, ao rubro, a alça de platina (alça de inoculação); 
- Transferir uma porção, 1 gota do meio (do tubo de cultura) para a área central da lâmina; 
- Espalhar, esfregando o material numa pequena área (1 a 2 cm); 
- Flambar, ao rubro, novamente a alça de platina; 
- Deixar secar ao ar, antes de submetê-la a coloração. 
 
 
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• Micro-organismos em meio sólido: 
- Preparar a lâmina do modo referido anteriormente; 
- Colocar previamente 1 gota de solução salina (0,85% de cloreto de sódio) estéril sobre a lâmina 
de vidro; 
- Flambar, ao rubro, a alça de platina; 
- Recolher uma pequena porção do crescimento de micro-organismos; 
- E diluir na gota de salina espalhando as células em movimentos circulares, por uma pequena 
área de, aproximadamente 1 a 2 cm; 
- Deixar secar ao ar; 
- Fixá-la pelo calor passando a lâmina de vidro, contendo o esfregaço seco ao ar, 3 vezes sobre 
a chama do bico de Bunsen, antes de submetê-la a coloração. 
 
Coloração de Gram 
 
• Cobrir o esfregaço, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, com solução de cristal violeta 2% 
durante 1 a 2 minutos; 
• Lavar ligeiramente com água corrente. Escorrer; 
• Cobrir o esfregaço com lugol, usando uma pipeta Pasteur, durante 1 a 2 minutos; 
• Descorar rapidamente com álcool a 95%; 
• Lavar ligeiramente com água corrente. Escorrer; 
• Contra corar com uma solução de fucsina ou safranina, durante 30 segundos; 
• Lavar com água corrente e enxugar entre dois lenços de papel absorvente, com cuidado, sem esfregar; 
• Examinar ao microscópio óptico com a lente objetiva de imersão (100x). Para observação na objetiva 
de imersão não esquecer de adicionar sobre o esfregaço corado uma gota de óleo de imersão. 
 
QUESTÕES PARA DISCUSSÃO 
 
01 – A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de 
infecções humanas e animais? Citar pelos menos um exemplo. 
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02 – Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes que integram a 
metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com modificações (exclusões ou 
inversões) da sequência referida nos procedimentos. 
 
REFERÊNCIAL BIBLIOGRÁFICO 
 
MARTINS, Cláudia Renata Fernandes et al. Técnica de Coloração de Gram: Brasília: Ministério da Saúde, 
Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. Brasília: Ministério da Saúde, 
2001. 
 
MARTINS, Janaína Cunha; CARVALHO, Natália Sales de. Manual de Aulas Práticas de Microbiologia 
Geral Destinado a Monitores. Fortaleza:Universidade Estadual do Ceará. Centro da Ciência da Saúde. 
Curso Nutrição. Setor Microbiologia, 2008. 
 
SOARES, Juarez Braga. Microbiologia básica por Juarez Braga Soares, Antonio Renato S. de Casimiro e 
Laurênia Maria B. Aguiar. Fortaleza, edições UFC, 1987. 
 
TORTORA, GERARD J. Microbiologia/ Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case; trad. atual. 
por Roberta Marchiori Martins. – 8. ed. – Porto Alegre: Artmed, 2005. 
 
VERMELHO, Alane Beatriz. Práticas de microbiologia/Alane Beatriz Vermelho... [et al.]. – Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2006.