Vamos analisar as informações passo a passo para identificar a alternativa correta sobre o sequenciamento de DNA, especialmente o método de Sanger: - O método de Sanger baseia-se na síntese de fragmentos de DNA de diferentes comprimentos que começam em um ponto comum (onde o primer se liga) e terminam em nucleotídeos marcados. - Após a desnaturação do DNA, um primer é ligado na extremidade 3' do molde (não na 5'), para que a DNA polimerase possa sintetizar a cadeia complementar na direção 5' → 3'. - Os fragmentos sintetizados terminam em nucleotídeos didesoxinucleotídeos (ddNTPs), que são quimicamente modificados, pois não possuem o grupo hidroxila 3' (3'-OH), impedindo a adição de novos nucleotídeos e, assim, terminando a síntese. - Esses fragmentos são separados por eletroforese capilar e detectados por fluoróforos diferentes ligados aos ddNTPs, permitindo a leitura da sequência. Agora, analisando as afirmações da pergunta: A) Fragmentos de DNA de comprimento crescente que começam em um ponto comum e possuem todos os quatro tipos de nucleotídeos nas extremidades → correto. B) Primer colocado na extremidade 5' do molde → incorreto, o primer é ligado na extremidade 3' do molde para que a síntese ocorra na direção 5' → 3'. C) Fragmentos terminados em nucleotídeos diferentes, cada um marcado com fluoróforo diferente, separados por cores → correto. D) Nucleotídeos modificados que não possuem 3'-OH, impedindo a continuação da síntese → correto. E) Método de Sanger revolucionou o sequenciamento pela não utilização de substâncias radioativas → correto, pois substituiu marcadores radioativos por fluoróforos. Portanto, a alternativa correta é a que afirma que os nucleotídeos empregados são quimicamente modificados de forma que não apresentam o terminal hidroxila 3'-OH, impedindo a inserção de um novo nucleotídeo pela DNA polimerase. Resposta correta: D) Os nucleotídeos empregados nessa técnica são quimicamente modificados de forma que não apresentam um terminal hidroxila (3'-OH), impedindo a inserção de um novo nucleotídeo pela DNA polimerase.