Como se realiza a coloração de flagelos e esporos bacterianos?

TÉCNICAS DE COLORAÇÃO PARA FLAGELOS

Coloração para flagelos

Os flagelos são organelas das bactérias responsáveis pela motilidade, os quais possuem, em sua constituição, moléculas protéicas denominadas “flagelinas”. O flagelo é formado por  milhares de monômeros polimerizados de flagelina ordenados de maneira a formar  um único flagelo.

Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de  estrutura em uma bactéria:

a) A produção de flagelos nas bactérias não é contínua e é dependente de vários fatores  como temperatura, substrato, estágio do crescimento, etc;

b) Os flagelos podem ser acidentalmente removidos da bactéria pela pipetagem ou  homogeneização muito vigorosa;

c) O flagelo se despolimeriza facilmente, isto é, se dissocia  em monômeros de flagelina com freqüência (quando a temperatura  alcança mais de 60ºC, quando o pH se torna muito ácido (pH 4,0) e  quando a célula está em presença de álcalis, de uréia e de solventes  orgânicos);

d) É necessária a aplicação de técnicas para aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pelas técnicas microscópicas usualmente adotadas em laboratórios  microbiológicos.

O ácido tânico contido no corante se ligará ao flagelo, tornando-o mais grosso. A  demonstração do flagelo ocorrerá devido à ligação do corante ao ácido tânico.

Procedimento

a) Preparar cultura da bactéria em estudo sobre a superfície de ágar infusão de cérebro  ou em ágar soja triptona (com ou sem sangue), incubando em temperatura e tempo adequados;

b) Transferir delicadamente uma alçada do crescimento para tubo contendo cerca de  3mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspensão. Colocar uma  gota desta suspensão sobre uma lâmina e deixar secar ao ar;

c) Cobrir a lâmina com o corante e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico  esverdeado cubra metade da área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina;

d) Retirar o corante enxaguando com água;

e) Secar;

f) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

TÉCNICA PARA COLORAÇÃO DE ESPOROS (Wirtz-Conklin)

Coloração com verde malaquita

A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e a saída de materiais do esporo.  O tempo prolongado de exposição ao corante (verde malaquita), associado ao  aquecimento, permite o rompimento desta barreira obtendo-se, então, o esporo corado em  verde intenso. Como contracorante é utilizada a safranina, que cora outras estruturas em rosa,  facilitando a diferenciação dos esporos.

Procedimento

a) Preparar esfregaço e fixar pelo calor;

b) Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita;

c) Aquecer água em um Becker até começar a sair vapor.  Colocar a lâmina sobre este becker, mantendo o corante aquecido por 5 minutos.  Alternativamente, cobrir a lâmina com verde malaquita e aproximar o máximo possível de uma chama de bico de Bunsen e deixar até que desprenda vapor. Afastar do fogo e após 1 a 2  minutos repetir a operação por 3 a 4 vezes;

Obrigada, Mariana! Agora só falta mesmo saber: Qual amostra clínica utilizada; Como libera o resultado; e controle de Qualidade Interna.