Pasos para a elaboracao da lamina histologica

1. Fixação

 Após a coleta da amostra biológica (biópsia, necrópsia ou peças cirúrgicas), deve-se primeiramente fixá-la com o objetivo de manter a estrutura e a composição mais próxima a do tecido in vivo e impedir a ação de bactérias e enzimas proteolíticas (autólise) que provocariam a degradação tecidual. A fixação pode ser realizada por métodos físicos (aquecimento, resfriamento) ou por métodos químicos (formol, líquido de Bouin). Os fixadores atuam estabelecendo ligações transversais entre as proteínas intra e intercelulares. Quando a amostra é espessa, realiza-se, a sua clivagem para permitir a melhor penetração do fixador. Outra peculiaridade está em amostras de tecido mineralizados, que precisam ser descalcificados para permitir a sua fixação.

2. Desidratação e diafanização:

Fixada a amostra, procede-se a sua desidratação através de banhos de álcool em concentrações crescentes, de etanol 70% a etanol 100%. Após a desidratação, realiza-se a sua diafanização ou clareamento com a finalidade de substituir o etanol presente na amostra por um substância intermediária que seja miscível tanto em etanol como na substância utilizada na etapa seguinte (inclusão) para enrijecer a amostra. Essa substância intermediária é o xilol . Ao final desta etapa, os tecidos se tornam transparentes. 

3. Inclusão:

Após a diafanização, a amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o calor promove a evaporação do xilol e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. O tecido embebido por parafina se torna rígido após ser retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em relação à parafina é que aquela produz menos artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa. 

4. Microtomia

Na penúltima etapa, os blocos de tecido são levados ao micrótomo para serem cortados em cortes finos de 1 a 10µm. A microtomia também pode ser efetuada em espécimes congelados, seja em nitrogênio líquido seja por congelamento rápido, no braço de um criostato a -20°C com uma lâmina de aço pré-resfriada. 

5. Coloração

As lâminas são, em seguida, coradas com corantes específicos para que possam ser visualizadas e diferenciadas as estruturas específicas que se quer observar. Os corantes são hidrossolúveis e podem ser acidófilos ou basófilos. Os corantes basófilos são básicos e coram estruturas teciduais ácidas como os ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA), o núcleo e os ribossomos. Como exemplo de corantes basófilos, destacam-se a Hematoxilina, o Azul de Metileno e o Azul de Toluidina. Os corantes acidófilos são ácidos e coram estruturas teciduais básicas como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. Como exemplo de corantes acidófilos, destacam-se a Eosina, Orande G, Fucsina ácida.  

A combinação mais utilizada é a de Hematoxilina com Eosina (HE). A Hematoxilina cora em azul ou violeta e a Eosina, em cor-de-rosa. Outros corantes utilizados são os tricrômios (corantes de Mallory e Masson), importantes na diferenciação entre colágeno e músculo liso. Além deles, a impregnação por metais, como a prata e o ouro, é comum no estudo de tecido nervoso.

O tecido a ser analisado deve ser preparado para permitir a passagem da luz através dele e a visualização de estruturas específicas através da aplicação de corantes específicos. Vários são os métodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in vivo até aqueles que utilizam os tecidos mortos. O método mais utilizado em Histologia é o preparado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico.

O processo de preparação das lâminas histológicas pode ser dividido em \(7\) etapas: 

1. Coleta da amostra
   • Processo de obtenção do tecido a ser estudado;
   • Alguns métodos utilizados são: biópsia, necrópsia ou peças cirúrgicas. 
2. Fixação

   • Objetiva manter a estrutura e a composição mais próxima a do tecido in vivo;

   • Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis;

   • Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores;

   • Preservar os vários componentes celulares e tissulares;

   • Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos;

   • Facilitar a subseqüente coloração;

   • Impedir a ação de bactérias e enzimas proteolíticas que provocariam a degradação tecidual.

3. Desidratação e diafanização

   • A desidratação é realizada imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico;

   • A diafanização objetiva a infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. 

4. Inclusão

   • A amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo.

5. Microtomia

   • Os blocos de tecido são levados ao micrótomo para serem cortados em cortes finos

6. Colagem

   • As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi.

   • Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam.

   • Após o que o corte é “pescado” com a lâmina, preparada com albumina, na qual se adere

7. Coloração

   • Etapa tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A coloração é de importância fundamental em histologia, pois os tecidos não tratados têm pouca diferenciação óptica.

Referências:

Adaptado de: 

http://compartilhandoamedicina.blogspot.com/2013/12/histologia-tecnicas-de-preparacao-de.html

http://histologiavet.blogspot.com/2007/02/etapas-na-preparao-dos-tecidos-ou-rgos.html

https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/preparacao-de-lamina-histologica-fixacao/31098