Aula 1 Extração de ácidos nucleicos

Prévia do material em texto

Disciplina: Plataformas Moleculares para as
Atividades Biológicas
Aula 1: Extração de ácidos nucleicos
Apresentação
Imagine que você já seja um pesquisador, e trabalhe em um laboratório especializado no diagnóstico de doenças genéticas.
Na rotina das atividades de bancada, você precisa isolar o genoma dos pacientes em análise. Com toda a experiência
adquirida ao longo da sua formação, você sabe os cuidados necessários para superar uma série de barreiras físicas,
químicas e biológicas associadas às células e ao próprio ácido nucleico, que di�cultam o acesso a esse material. 
Nesta aula, conheceremos a composição das moléculas dos ácidos nucleicos, suas propriedades, e ligações químicas que
garantem sua estabilidade, auxiliam no sucesso das técnicas de isolamento e na puri�cação do DNA/RNA para �ns de
diagnóstico e pesquisa na área de Genômica e Biologia Molecular.
Bons estudos!
Objetivos
Enumerar as etapas necessárias para a extração do ácido nucleico;
Discutir os princípios da técnica de extração passo-a-passo;
Correlacionar o sucesso da técnica de extração com as características e propriedades das moléculas de ácido nucleico.
Moléculas de DNA e RNA
O ácido desoxirrobonucleico (DNA) é
uma molécula orgânica que compõe o
nosso código genético. Ele armazena
uma série de informações importantes
de modo permanente na forma dos
genes.
Os genes do DNA são temporariamente
copiados em intermediários de ácido
ribonucleico (RNA) na etapa de
transcrição no �uxo da informação
gênica. As moléculas de RNA serão
utilizadas posteriormente para sintetizar
as proteínas e enzimas responsáveis
pela maioria das funções celulares na
etapa de tradução.
Essas proteínas estão associadas ao crescimento e à divisão celular, controle e regulação das atividades celulares, metabolismo,
manutenção da homeostase, reprodução, mecanismos de hereditariedade, expressão fenotípica, evolução, entre outros. Observe
na �gura a seguir:
 Fluxo da informação gênica | Fonte: Designua / Shutterstock
Nos procariotos, o material genético encontra-se no citoplasma. Já nos eucariotos, o material genético encontra-se
principalmente no núcleo, mas também pode ser encontrado em algumas organelas, como nas mitocôndrias (animais) e
cloroplastos (vegetais).
Lise celular
Você deve se lembrar que o material genético de eucariotos se encontra protegido das demais organelas
celulares pela membrana nuclear, correto?
Então, imagine que, para poder acessá-lo, você precise inicialmente vencer as membranas celulares. Mas, você deve estar se
perguntando...
Como poderia ser possível atravessar essas barreiras físicas?
Para responder a essa pergunta, basta relembrarmos a composição das membranas biológicas.
As membranas biológicas são constituídas principalmente por uma bicamada fosfolipídica.
 Estrutura da bicamada fosfolipídica da membrana celular ou membrana citoplasmática | Fonte: Kallayanee Naloka / Shutterstock
Ou seja, o principal desa�o nessa primeira etapa é romper a bicamada de lipídeos, liberando, então, o material genético. Em teoria,
você pode achar que isso é uma tarefa difícil. Mas, muito pelo contrário, tenho certeza que você faz isso todo dia, sem ao menos
perceber!
Vejamos um exemplo:
Para tirarmos o excesso de gordura da louça na cozinha, o
que você costuma utilizar? Detergente, certo?
Os detergentes são excelentes para a emulsi�cação de
gorduras. Dessa forma, portanto, são ideais para desestabilizar
as membranas biológicas, facilitando a lise das mesmas.
Existe uma série de detergentes que podemos utilizar em laboratório. Os principais detergentes utilizados são o dodecil sulfato de
sódio (SDS), Triton X-100 e o brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB).  
Dependendo do tipo de amostra que estivemos trabalhando, além dos detergentes, também é possível promovermos a ruptura
por meio de processos mecânicos — como maceração e homogeneização, utilizados em protocolos aplicados a tecidos, térmicos
—, de choque térmico, e aquecimento, que aumenta o grau de agitação molecular, ou de ondas sonoras — como sonicação.
Atividade
1. INMETRO (2010): A biotecnologia trabalha predominantemente manipulando material genético de seres vivos; para a maioria
dos organismos, o material genético é a molécula de DNA. Acerca da estrutura da molécula de DNA, assinale a opção correta:
a) O DNA é composto por quatro tipos de bases nitrogenadas: adenina, citosina, timina e uracila.
b) O açúcar contido na molécula de DNA é a ribose.
c) Em uma cadeia de DNA, os nucleotídeos se ligam aos açúcares e fosfatos por pontes de hidrogênio.
d) As duas fitas que compõem a molécula de DNA são ligadas por pontes de hidrogênio entre suas bases nitrogenadas.
e) Há complementaridade entre as bases nitrogenadas adenina e timina e entre guanina e uracila.
Puri�cação
A ruptura das membranas biológicas não é seletiva, ou seja, ela expõe todo o conteúdo celular, seja ele citoplasmático e/ou
nuclear, e não apenas o seu produto de interesse.
Dessa forma, proteínas, organelas, restos celulares, e outros contaminantes se encontram
presentes no lisado, e representam os alvos a serem eliminados nas etapas subsequentes
de extração, mas em condições que preservem o ácido nucleico.
Isso faz com que seja necessário sequestrar os cátions bivalentes que possam atuar como cofatores enzimáticos de
endonucleases prejudiciais ao processo, e contornar o pH ideal para ação dessas enzimas.  
As enzimas endógenas que degradam DNA (DNAses) utilizam Ca e Mg como cofatores, e apresentam pH ótimo ~ 7. Uma
forma de resolver esse desa�o seria adicionar à solução de lise um tampão Tris-HCl (pH 8,0) na presença de ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), um agente quelante. Dessa forma, você garante que sua lise não só seja e�ciente, como
também preserve o seu material.
Lembre-se da composição e estrutura do ácido nucleico!
+2 +2

O DNA é um polímero de nucleotídeos, que se
encontra na forma estrutural de dupla hélice.
Suas �tas são compostas por um esqueleto de açúcar (pentose) e fosfato, e apresentam-se antiparalelas, mantidas unidas por
complementariedade de bases nitrogenadas púricas (adenina, A; guanina, G) e pirimidínicas (citosina, C; timina, T); em que A se
liga a T, e C se liga a G, por duas e três pontes de hidrogênio, respectivamente, conforme ilustra a �gura a seguir.
 Pareamento das bases nitrogenadas na molécula de DNA | Fonte: Khanacademy <https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-discovery-and-
structure/a/discovery-of-the-structure-of-dna>
Em cada �ta de DNA, ligações fosfodiéster são estabelecidas entre o grupo hidroxila do carbono de um nucleotídeo, e o
grupamento fosfato do nucleotídeo seguinte. Observe na �gura a seguir.
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-discovery-and-structure/a/discovery-of-the-structure-of-dna
 Composição e estrutura dos ácidos nucleicos | Fonte: Khanacademy <https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-discovery-and-
structure/a/discovery-of-the-structure-of-dna>
Existem diferenças nas moléculas de DNA e RNA no que diz respeito à sua apresentação, e composição de açúcar e bases
nitrogenadas.
Vejamos:
 Estrutura molecular do DNA e RNA | Fonte: Yarkeen / Shutterstock.
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-discovery-and-structure/a/discovery-of-the-structure-of-dna
Para garantir a estrutura helicoidal, além das pontes de hidrogênio que mantém os �lamentos de DNA unidos, veri�camos as
interações hidrofóbicas entre as bases nitrogenadas, as quais são responsáveis por minimizar o contato dos seus anéis com a
água.
Atenção
Deve-se lembrar da repulsão eletrostática entre os grupamentos fosfato, os quais diminuem a estabilidade da estrutura da dupla
hélice, mas que podem ser compensadas pela presença das proteínas carregadas positivamente, como as histonas, que
assumem um papel estrutural, garantindo o empacotamento da cromatina.
Após essa breve revisão, �ca fácil entender quepara dar continuidade ao protocolo de extração e conseguir puri�car o ácido
nucleico, é necessário desmembrar as proteínas que se encontram associadas ao genoma, bem como isolar os demais
componentes celulares que poderiam representar impurezas no produto �nal.
O que você imagina, então, que pode ser utilizado na etapa de puri�cação?
Enzimas
Inicialmente, poderíamos utilizar enzimas para hidrolisar as
proteínas. Uma enzima bastante utilizada nesses
procedimentos é a proteinase K. Trata-se de uma
serinoprotease responsável pela digestão enzimática do
material.
Agentes caotrópicos
Paralelamente, também podem ser usados agentes
caotrópicos como o tiocianato de guanidina, um potente
agente desnaturante de proteínas, inibindo a atividade de
ribonucleases.
Solventes orgânicos
O uso de solventes orgânicos como fenol-clorofórmio auxilia
na separação de fases de ácidos nucleicos, proteínas, lipídios e
polissacarídeos, em função da diferença de solubilidade entre
esses componentes.
Enquanto o ácido nucleico permanece na fase aquosa ou superior, os demais componentes se dissolvem no solvente orgânico,
permitindo a separação após centrifugação e sucessivas lavagens.
Em função da toxicidade desses reagentes, uma alternativa seria utilizar a técnica de salting out, que facilita a precipitação de
proteínas em altas concentrações de sal, ou usar colunas com membrana de sílica, nos quais o ácido nucleico se adsorve de
forma seletiva, �cando imobilizado, enquanto os demais contaminantes são eliminados, conforme ilustra a imagem a seguir.
 Coluna com membrana de sílica | Fonte: Nikita G. Bernadsky / Shutterstock
Atividade
2. SEDUC-RJ (2013): A diferença encontrada entre DNA e RNA em relação às bases nitrogenadas é:
a) DNA tem adenina e guanina como bases pirimidínicas.
b) RNA possui uracila, mas não possui timina como base purínica.
c) DNA apresenta timina e não uracila como base pirimidínica.
d) RNA possui adenina, citosina e guanina como bases purínicas.
e) DNA apresenta adenina e guanina como bases purínicas.
Precipitação
Em seguida, é necessário precipitar o ácido nucleico da fase
aquosa. Sabemos que o álcool é capaz de desidratar a
molécula de DNA, agregando o ácido nucleico na presença de
cátions monovalentes, como os íons como o Na+, os quais
neutralizam a carga negativa dos grupos fosfato.  
Na presença de íons positivos, as moléculas de DNA passam a
não sofrer repulsão de cargas e, aliado à insolubilidade em
álcool, tendem a precipitar.
 Moléculas de DNA | Fonte: Crystal light / Shutterstock
Atenção
Quanto mais gelado o álcool estiver, menos solúvel o DNA estará em meio aquoso. Dessa forma, o uso de etanol/isopropanol na
presença de NaCl podem favorecer essa aglomeração.
Hidratação
Basta hidratar o ácido nucleico precipitado.
Podemos recuperá-lo, então, por meio da solubilização em água ou em tampão de armazenagem, e estimar a sua concentração
através de espectofotometria.
 Estrutura de DNA | Fonte: Molekuul_be / Shutterstock
Um pouco mais de conhecimento
Hoje em dia existem uma série de kits especí�cos comerciais disponíveis para uso em laboratório, os quais facilitam a rotina na
bancada, otimizam o tempo despendido com a técnica, e melhoram a qualidade do produto �nal em termos de integridade,
pureza, e rendimento, garantindo o sucesso no diagnóstico e na pesquisa molecular subsequente. Entretanto, sabemos que a
medicina forense tem obtido sucesso em sua rotina, mesmo com concentrações mínimas de ácido nucleico.
Após relembrar as características e propriedades das moléculas de DNA e RNA, mesmo que seu laboratório atravesse restrições
orçamentárias, agora que você já conhece o fundamento da técnica de extração, bem como as etapas que precisam ser vencidas,
você já é capaz de realizar uma técnica de extração orgânica in house. 
Esse protocolo pode ser adaptado para células vegetais, diferentes tipos de espécimes clínicos (sangue, saliva, bile, líquor, e
diferentes tipos de tecidos), e até mesmo para a pesquisa de DNA bacteriano, além do genoma de agentes patogênicos virais,
seja ele DNA ou RNA.
Atividade
3. IFN-MG (2016): Hoje em dia, o trabalho com material genético tornou-se rotineiro. Para uma correta extração de ácidos
nucleicos, é importante a escolha adequada de protocolos e reagentes para aquele material que se quer extrair e para que �m se
destina. Em um protocolo de extração de DNA ou RNA, não se deve usar como reagente:
a) Proteases.
b) Tampão.
c) Nucleases.
d) Sais.
e) Nenhuma da opções acima.
4. FIOCRUZ (2010): Para a extração de RNA/DNA, uma das etapas mais importantes é a eliminação das proteínas durante o
processo de puri�cação. Para a eliminação de proteínas na extração de RNA/DNA, assinale a a�rmativa inadequada:
a) Digestão das amostras com a enzima proteinase K.
b) Extrações com misturas de solventes orgânicos com fenol e clorofórmio por repetidas vezes.
c) Solubilização em tampões de guanidina.
d) Precipitação salina.
e) Solubilização em tampões ácidos (pH menor que 3,5).
5 - Em relação ao protocolo de extração de ácidos nucleicos, identi�que as principais etapas representadas na �gura a seguir, que
estão numeradas de 1 a 4 (Imagem adaptada de Biology Videos).
 Fonte: Biolvid <//biolvid.blogspot.com/2016/03/nucleic-acid-extraction-dna-isolation.html>
Notas
Referências
ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J.; RAFF, M.; WALTER, P.; ROBERTS, K.; MORGAN, D. Biologia Molecular da Célula. 6.ed. Porto
Alegre: Editora ArtMed, 2017.
BIANCO, B.; LIPAY, M.V.N. Biologia Molecular – Métodos e Interpretação. 1.ed. São Paulo: Roca, 2015.
MENCK, C. F. M.; SLUYS, M-A. V. Genética Molecular Básica: dos Genes aos Genomas. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2017.
WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; STEPHEN, P. B.; GANN, A.; LEVINE, M.; LOSICK, R. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre:
Editora ArtMed, 2015.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia Molecular Básica. 5.ed. Porto Alegre: Editora ArtMed, 2014.
Próxima aula
Ampli�cação de ácido nucleico;
Interferências e variações na/da técnica;
https://biolvid.blogspot.com/2016/03/nucleic-acid-extraction-dna-isolation.html
Analogia com processos de replicação e mitose.
Explore mais
Pesquise na internet, sites, vídeos e artigos relacionados ao conteúdo visto.
Em caso de dúvidas, converse com seu professor online por meio dos recursos disponíveis no ambiente de aprendizagem.