Antibiograma: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos

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Antibiograma 
Técnica destinada à determinação da sensibilidade/resistência bacteriana in 
vitro frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de Sensibilidade 
a Antimicrobianos (TSA). Interpretar a categoria de sensibilidade de acordo com os 
critérios estabelecidos CLSI (2011). Clinical and Laboratory Standards Institute. 
 
Finalidade 
• Terapia antimicrobiana dirigida 
• Conhecer o fenótipo de sensibilidade de um microrganismo 
• Perfil epidemiológico 
 
Indicação do teste de sensibilidade 
para qualquer organismo que: 
• contribua para o processo infeccioso 
• requer terapia antimicrobiana 
• sua sensibilidade não pode ser prevista quando do conhecimento da 
espécie envolvida 
• pertença a uma espécie capaz de exibir resistência aos antibióticos mais 
comumente empregados 
 
Métodos de antibiograma 
• Método da difusão 
• Diluição em caldo – micro e macrodiluição 
• Métodos automatizados 
• Outros 
 
Disco-difusão 
Princípio: discos de papel de filtro com o antibiótico impregnado 
Finalidade: determinação qualitativa da sensibilidade 
Limitações: 
• pH 
• espessura do meio 
• estabilidade dos discos 
• detecção de alguns mecanismos de resistência 
• análise qualitativa e não quantitativa 
• leitura e interpretação pelo usuário 
• necessita de um mínimo de 18 a 24 horas de incubação 
Aspectos relevantes: 
• fácil execução 
• flexibilidade 
• utilizado pela maioria dos laboratórios de microbiologia 
• menor custo 
• aplicado a microrganismos de crescimento rápido 
 
O teste de disco-difusão em ágar - Kirby e Bauer (1966) 
Realização de um controle de qualidade 
Variáveis pode afetar o teste de disco-difusão 
Destacam-se: 
• O preparo dos meios de cultura; 
• O controle do pH do meio; 
• O tempo; 
• A temperatura e a atmosfera de incubação; 
• Concentração do inóculo; 
• O estoque adequado dos discos de sensibilidade; 
• O rigor na execução da técnica. 
Vantagens do método de disco-difusão em ágar 
• A fácil execução; 
• A reprodutibilidade; 
• A utilização de reagentes de baixo custo; 
• Resultados de fácil interpretação clínica; 
• Flexibilidade quanto à escolha dos antimicrobianos 
• Não exigência de equipamentos especiais 
Limitações 
• Não padronização para algumas combinações de microrganismos e 
agentes antimicrobianos (S. pneumoniae versus cefalosporinas e 
Acinetobacter spp. versus polimixinas, por exemplo); 
• Pode não ser adequado para a detecção de mecanismos de resistência 
 
Müller-Hinton: 
• pH -7,2 a 7,4 
• Ca e Mg – interferem aminoglicosídeos e tetraciclinas – P. aeruginosa 
• Altura do ágar – 3 a 5mm 
• 24mm um do outro 
• Placas 150mm – 12 discos; 100mm - 5 discos 
 
Preparo do inóculo bacteriano 
Objetivo: turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland turbidímetro. 
• Aproximadamente 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônias 
(UFC)/mL. 
• O inóculo bacteriano pode ser obtido por meio do método de crescimento 
ou da suspensão direta da colônia 
 
1 Método de crescimento: transferir 3 a 4 colônias - mesma morfologia para 3 
a 4 mL de caldo de Trypticase Soy Broth (TSB), solução fisiológica a 0,9%, ou caldo 
de Müeller-Hinton * 35±2 ºC até a turbidez atingir 0,5 da escala de McFarland: 
geralmente ocorre após 2 a 6 horas 2 Método da suspensão da colônia direta: 
transferir 3 a 4 colônias - mesma morfologia para 3 a 4 mL de caldo de TSB, solução 
fisiológica a 0,9%, ou caldo de Müeller-Hinton * comparar o inóculo com a escala 0,5 
de McFarland; 
Inoculação da placa: 5 minutos à temperatura ambiente 
Cepas que apresentam hemólise, tomar cuidado para ler a inibição do 
crescimento e não a hemólise 
• Técnica de Kirby e Bauer - é a mais utilizada: fácil execução, baixo custo 
e confiabilidade de seus resultados 
• Técnica de Kirby e Bauer – instruções seguidas rigorosamente: os 
resultados obtidos correspondam à realidade 
• *discos impregnados com antimicrobianos 
• 1 monodiscos (avulsos em frascos com 50 unidades) 
• 2 multidiscos (embalagens contendo 25 “estrelas” com 12 discos em 
cada). 
 
Fatores determinantes para realização do TSA: 
• Material clínico – cuidado com a microbiota normal; 
• Realização da técnica – passos seguidos rigorosamente conforme 
prescrito; 
• Escolha dos antimicrobianos – adequada 
• Pesquisa e confirmação de mecanismos de resistência 
• -Atualização: - grupos de antimicrobianos - grupo de microrganismo e de 
seus halos de interpretação (atualizações anuais das organizações 
internacionais) 
 
Quanto às amostras 
Tipo de amostra: Colônias puras de bactérias gram-positivas ou gram-
negativas - 18 a 24 horas 
Armazenamento e estabilidade: 
• Viáveis para a execução das análises até cerca de 24 horas em meio 
não seletivo 
• Além deste prazo - novo repique da cepa - cultivar por mais 24 horas em 
meio não seletivo para depois proceder ao exame. 
Critério para rejeição: 
As amostras que já ultrapassaram o prazo máximo de estabilidade devem ser 
rejeitadas para a análise, devendo ser repicadas em meio apropriado, e usadas 
colônias recentes. 
Verificar a pureza do inóculo, e na dúvida, sugere-se o repique da cepa. Em 
caso de contaminação, deve-se reisolar o microrganismo a ser testado para evitar 
erros na medição dos halos. 
Princípio da técnica: 
• Suspensão de bactérias de cultivo recente 
• Inoculação suspensão - ágar Müeller Hinton 
• Aplicação discos de papel impregnados com antimicrobianos 
• Incubação em estufa 
• Padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco 
• Medir o tamanho de cada halo 
• Resultado pesquisado em tabelas apropriadas segundo a espécie 
bacteriana em análise. 
Passos: 
➢ 1 Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se 
obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland 
(1x106 UFC/mL) 
➢ 2 Embeber um suab estéril na suspensão bacteriana 
➢ 3 Semear em seguida de forma 
➢ 4 Aguardar - superfície do ágar secar 
➢ 5 Colocar os monodiscos ou multidiscos 
➢ 6 Incubar a placa 
➢ 7 Resultados: medir diâmetro dos halos inibitórios do disco, e consultar 
tabela apropriada: sensível, intermediário ou resistente ao 
antimicrobiano testado 
Reagentes: 
• Discos de papel impregnados com antibióticos - concentração 
padronizada 
Armazenamento e estabilidade: 
• Geladeira (2-8 °C) ou freezer (abaixo de -10 °C) - não ocorrendo 
contaminação microbiana ou umidificação, o produto se manterá estável 
até a data de validade expressa em rótulo. 
Cuidados: 
• Seguir padronização técnica para execução da prova (CLSI, 2011) 
• Discos e meios à temperatura ambiente antes do uso 
• Observar critérios para escolha dos antibióticos apropriados para a 
bactéria em análise e suas resistências intrínsecas; 
• Abertura precoce do frasco - condensação de água - aumento da 
umidade e consequente inativação do antibiótico com queda em sua 
atividade 
• O meio de Müeller Hinton - deve estar com pH, composição química 
(íons cálcio, íons magnésio, timina e timidina) e espessura do ágar 
adequados; 
Atentar para: 
• Meios espessura média de 4 mm - 3 mm a 5 mm: respectivamente 
provocam resultados falsamente aumentados ou diminuídos; 
• Inóculos acima do padrão 0,5 da escala Mac Farland - resultados 
falsamente diminuídos e inóculos mais fracos resultados falsamente 
aumentados; 
• Pré-incubação - 5 minutos após a inoculação: remover o excesso de 
umidade, que pode causar a difusão errática do antibiótico após a 
implantação dos discos 
• A temperatura de incubação deve ser rigorosamente controlada 
• O tempo de incubação indicado não deve ser nem abreviado nem 
aumentado, sob risco de se obterem resultados falsamente diminuídos 
(pouco tempo) ou falsamente aumentados (mais tempo) 
• Placas 90x15 mm - no máximo 5 discos; placa 140x15 mm - colocados 
até 12 discos. Visa impedir que o contato entre os antimicrobianos 
difundidos no meio, - podendo fornecer distorções ligadas a sinergismo 
ou outros tipos deinteração. 
 
Principais fatores de erros na técnica: 
• 1 Erro na transcrição de dados 
• 2 Erro na leitura dos halos de inibição 
• 3 Erro na padronização do inóculo 
• 4 Contaminação ou alteração na cepa-controle (ensaio qualitativo de 
controle de qualidade) 
• 5 Padrão velho da escala de McFarlland (suspensão de sulfato de bário) 
• 6 Temperatura ou atmosfera impróprias para incubação 
• 7 Semeadura não homogênea no ágar 
• 8 Variações no desempenho do meio de cultivo 
• 9 Perda de potência do disco durante o armazenamento (excesso de 
umidade, temperatura inadequada, expiração do prazo de validade). 
Leitura interpretada 
• Classificação em resistente, intermediário e sensível 
• Tradução dos halos ou CIM 
• • Estabelece probabilidade de sucesso ou fracasso terapêutico 
• Os critérios utilizados são gerados em função do conhecimento 
microbiológico, de dados farmacológicos e da resposta terapêutica 
 
Aspectos clínicos do antibiograma 
• Testes de rotina nem sempre predizem eficácia clínica 
• Microrganismos podem apresentar sensibilidade “in vitro” mas a 
resposta clínica ao tratamento é falha 
 
Considerações finais 
• As bactérias apresentam uma versatilidade extraordinária para adquirir 
resistência 
• O antibiograma é a ferramenta mais importante para o início dos estudos 
dos mecanismos de resistência.