A maior rede de estudos do Brasil

Grátis
54 pág.
Metodos de Imunodiagnostico 2011_1

Pré-visualização | Página 1 de 2

1
Métodos de Imunodiagnóstico
Walter M. R. Oelemann
Depto. Imunologia –IMPPG
Bibliografia:
Kuby Immunology 4ª ed. capítulo 6
Vaz, Takei & Bueno Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações
Benjamini et al., Immunology, 4ª ed.
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm
2
• Interação antígeno – anticorpo 
= associação bimolecular
• Reversível
• Altamente específica
• Especificidade levou ao desenvolvimento de vários 
imunoensáios
3
• Imunoensaios são usados para
– detecção de anticorpos específicos em flúidos corporais 
do paciente
– detecção de antígeno patógeno-específico no espécime 
clínico
• Imunoensaios exercem papel importante 
– no diagnóstico de doenças
– no monitoramento da resposta humoral 
– na identificação de moléculas de interesse biológico ou 
médico
4
• Imunoensaios diferem
– na velocidade de sua execução
– em sua sensibilidade e especificidade
– no tipo de resultado obtido
• qualitativo
• quantitativo
• Princípio:
interação in vitro entre Ac e Ag e detecção 
subsequente dos imunocomplexos formados
5
AG AC AG AC+
6
DETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOS
AG AC
SISTEMA
REVELADOR
Precipitação
Aglutinação
MonoclonaisPoliclonais
Enzima
Radioisótopo
Fixação
do C`
Fluorocromo
Íntegro
Recombinante
Peptídeo
Extrato
Purificado
7
Visão geral de imunoensaios (1)
• Interação ente Ac e Ag solúvel em solução aquosa 
resulta em uma rede tridimensional de 
imunocomplexos que, por fim, desenvolve um 
precipitado visível precipitação
• Precipitação em líquidos
• Precipitação em géis
– Imunodifusão radial (método de Mancini)
– Imunodifusão dupla (método de Ouchterlony)
– Imunoeletroforese
Tipos de epítopos (determinantes antigênicos)
8
9
10
11
12
Precipitação
Excesso de anticorpo inibe a precipitação!
O Ac só pode se ligar de forma monovalente
Efeito pro-zona
13
Precipitação em gel
14
Visão geral de imunoensaios (2)
• Interação ente Ac e Ag particulado em suspensão aquosa 
resulta em uma rede tridimensional de imunocomplexos
que, por fim, desenvolve um precipitado visível 
aglutinação
• Hemaglutinação: tipagem ABO
• Aglutinação bacteriana: Salmonella typhi
• Aglutinação passiva
• Inibição da aglutinação
15
Hemaglutinação 
• Tipagem ABO
– Misturar eritrócitos a 
serem tipados com anti-
soro anti-A ou anti-B
– Quando antígeno está 
presente na superfície dos 
eritrócitos, estes aglutinam
16
Hemaglutinação indireta (passiva) 
• Eritrócitos de carneiro recobertos 
(“sensibilizados”) com mistura de antígenos 
(ex.: T. cruzi)
• Teste c/ soro de pacientes chagásicos em 
diferentes diluições seriadas
• Efeito pro-zona devido a
– Concentração de Ac demasiadamente alta 
(ligação monovalente)
– Antícorpos que ligam o Ag são incapazes 
de aglutinar
Ac incompletas (frequentemente da 
classe IgG)
– Bons Ac aglutinadores: IgM
17
Inibição da hemaglutinação 
• Modificação da reação de aglutinação
• Ensaio altamente sensível p/ detecção de pequenas quantidades 
de Ag
– Teste de gravidez
– Teste anti-droga: 
• Amostra de urina incubada c/ Ac contra a droga; Adição de 
hemácias sensibilizadas c/ a droga; Ausência de aglutinação 
sugere presença da droga na urina
18
Teste de gravidez 
19
Radio-imunoensaio (RIA) em fase líquida ou sólida
• Ensaio mais sensitivo p/ detecção de 
Ac ou Ag
• Ligação competitiva entre Ag não 
marcado e Ag radioativamente 
marcado c/ Ac de alta afinidade
• Ag marcado misturado c/ Ac em conc. 
que saturam os sítios de ligação no Ac
• Adição de quantidades crescentes da 
amostra a ser testada contendo Ag não 
marcado em quantidade desconhecida
• Ac interage c/ ambos os tipos de Ag
• Quanto mais Ag não marcado estiver 
presente, mais Ag marcado vai ser 
substituído nos imunocomplexos
RIA
20
21
Imunoensaios em fase sólida
• ELISA (enzyme-linked 
immonosorbent assay) 
• = Ensaio imunoenzimático 
(EIA)
• Western blot
• Antígeno adsorvido em 
superfície sólida
• Reação com soro de paciente
• Imunocomplexo formado 
detectado por anti-anticorpo
marcado com enzima 
(“conjugado”)
22
Determinantes antigênicas nas Ig
• Anticorpos são glicoproteínas
• São potentes imunógenos (em espécies diferentes)
• Anti-anticorpos (anti-Ig) ferramentas valiosas no estudo do 
desenvolvimento da célula B e da resposta humoral
• 3 tipos diferentes de determinantes:
– Determinantes isotípicas
– Determinantes alotípicas
– Determinantes idiotípicas
22
23
Determinantes antigênicas nas Ig: Isotipo
• Determinantes das regiões constantes de ambas as cadeias 
• Definem as classes de Ig
• Idênticos em indivíduos da mesma espécie
Geração de anti-anticorpos
• Anti-anticorpos reconhecem determinantes isotípicas
– Ig de humano purificado injetado em camundongo
– Camundongo produz anti-Ig Humano
– Anti-Ig pode ser „conjugado‟ com enzima 
• Fosfatase alcalina (AP)
• Peroxidase (HRP)
24
25
ELISA (1)
• Conjugado: 
– anti-IgGhum-HRP; 
– anti-IgAhum-HRP; 
– anti-IgMhum-HRP; 
– anti-Ig totalhum-HRP
• No ELISA, a enzima transforma um substrato incolor solúvel em um 
produto colorido solúvel
26
27
ELISA (2)
ELISPOT
• ELISA tipo sandwich
• Detecção de células T 
Mtb-específicas no 
sangue periférico
• Indício de infecção 
ativa
28
29
30
Western Blot (2)
Anode (+)
Catode (-)
31
Western Blot (3) exemplo: doença de Chagas
No WB, a enzima transforma um substrato incolor solúvel em um produto 
colorido insolúvel
HIV
32
Percurso da infecção por HIV (1)
HIV
34
Percurso da infecção por HIV (2)
36
Reatividade Cruzada
Definição e Causa:
• Dois Ag‟s diferentes compartilham um epítopo idêntico
• Ac específico para um epítopo liga-se a um epítopo não 
relacionado mas com propriedade químicas semelhantes
Performance de ELISA
• Avaliação do protocolo com um painel de 
soros
• 100 amostras positivas
– obtidas de pacientes confirmados com 
sintomatologia e isolamento viral
• 100 amostras negativas
– obtidas de indivíduos sadios, sem sintomas 
(ex. doadores de sangue)
37
SENSIBILIDADE
= capacidade do ensaio de identificar como positivos todos os 
espécimes clínicos provenientes de indivíduos doentes
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
38
SENSIBILIDADE S
= capacidade do ensaio de identificar como positivos todos os 
espécimes clínicos provenientes de indivíduos doentes
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
39
• Das 100 amostras positivas, o 
teste é positivo para 99. 
• 1 amostra é falso-negativa
• S = 99/100 = 99%
ESPECIFICIDADE
= capacidade do ensaio de identificar como negativos todos 
os espécimes clínicos provenientes de indivíduos sadios
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
40
ESPECIFICIDADE E
= capacidade do ensaio de identificar como negativos todos 
os espécimes clínicos provenientes de indivíduos sadios
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
41
• Das 100 amostras negativas, 
o teste é negativo para 98. 
• 2 amostras são falso-positivas
• E = 98/100 = 98%
O ensaio apresenta 99% de sensibilidade e 98% de especificidade
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 2 101
Teste 
não 
reativo
1 98 99
Total 100 100 200
42
• A “população” apresenta uma 
prevalência da doença de 50% 
(100/200). 
• Se o resultado do teste é positivo, 
qual a probabilidade de que o 
indivíduo testado realmente tem a 
doença?
• Valor preditivo positivo (VPP)
• VPP = VP / (VP + FP)
• VPP = 99 / (99 + 2) = 98,02%
Populações com diferentes prevalências
Doença 
presente
Doença 
ausente
Total
Teste 
reativo
99 198 297
Teste 
não 
reativo
1 9.702 9.703
Total 100 9.900 10.000
Doença 
presente
Doença