Biologia Celular - Informações básicas sobre montagem de lâminas

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LÂMINAS PERMANENTES
Vantagens: As lâminas permanentes têm a vantagem de poderem ser seladas a vácuo
dentro do quadro para impedir o movimento ou vazamento, tornando-as ideais para o
transporte ou visualizações repetidas de apresentações.
Desvantagens: As lâminas permanentes podem apresentar dificuldades quanto a sua
correta especificação, além de possuírem custo elevado. Certos tipos de lâminas
permanentes são feitas para determinados tipos de amostras. Se você não tem certeza do
tipo de lâmina que precisa, pode acabar com uma lâmina que não exibe corretamente o
objeto que você deseja ampliar
Finalidade: A utilização delas facilita a preservação da amostra por mais tempo em
comparação a uma lâmina temporária, sendo especialmente útil se a amostra for rara
Área de uso (Setor): Voltado para todos os setores de pesquisa de Universidades,
Faculdades, Institutos e Centros de Pesquisa que queiram preservar um material para
futuras análises
FIXAÇÃO
A fixação é o tratamento do tecido com agentes que mantêm a sua arquitetura normal. O
formol e o líquido de Bouin (formaldeído, ácido acético e ácido pícrico) são os agentes
fixadores mais utilizados em microscopia óptica, pois mantém uma imagem do tecido
semelhante à in vivo, através das ligações transversais entre as proteínas.
Objetivos da fixação são:
● Inibir ou interromper a autólise tecidual
● Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis
● Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos
técnicos posteriores
● Preservar componentes celulares
● Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos
● Facilitar a subsequente coloração.
Fonte:https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/preparacao-de-lam
ina-histologica-fixacao/31098
https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/preparacao-de-lamina-histologica-fixacao/31098
https://siteantigo.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/preparacao-de-lamina-histologica-fixacao/31098
Objetivos da fixação (Segundo outro site):
A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os
tratamentos posteriores. A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de
microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos
posteriores. O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de
artefatos. A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material que
irá ser usado para a inclusão. A solução de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH
7,4 ou a solução “formalina neutra tamponada” (NBF) são comumente usadas. Os fixadores
preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das proteínas,
através de pontes de hidrogênio. O glutaraldeído possui dois grupos aldeídos um em cada
extremidade de sua estrutura molecular que podem estabelecer pontes de hidrogênio entre
as proteínas. As moléculas de formaldeído, no entanto, possuem apenas um grupamento
aldeído, sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de proteínas
A técnica de fixação por imersão
O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume do fragmento
de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ação da periferia para o centro do material. As
porções periféricas do material são primeiramente fixadas em relação as suas porções mais
internas. A boa penetração de qualquer fixador está diretamente relacionada ao tamanho e
espessura do material. Entretanto, de acordo com o tipo de tecido, com a fixação de um
encéfalo, por exemplo, a fixação por imersão seria um método condenável, devido à
dificuldade de penetração da solução. Para estes casos sugere-se recorrer ao método da
perfusão
Fonte: http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm
DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO
● A maioria dos tecidos é composta por água, por isso são necessários banhos de
álcool em concentrações crescentes a fim de obter a desidratação. Após a
desidratação, há o tratamento dos tecidos com xilol, para que os tecidos tornam-se
transparentes, processo conhecido como diafanização.
● A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções alcoólicas
em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se
necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A
graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação
homogênea dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.
http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm
● Para que as células e os tecidos mantenham a sua forma original, a água não deve
ser simplesmente retirada, mas substituída por outro fluido. O ideal seria um líquido
que fosse miscível com a água e com a parafina, mas não há muitas substâncias
que façam isso sem inconvenientes, por isso se utilizam duas fases: na primeira
tira-se a água com um solvente e na segunda substitui-se este solvente por outro,
miscível em parafina.
O processo mais habitual utiliza o álcool 100% como primeiro solvente e o benzeno
ou xilol como segundo. A substituição da água por álcool 100% é um processo
gradual: se pegarmos na peça do fixador aquoso e a atirarmos para dentro de um
banho de álcool 100%, os tecidos vão-se deformar. A água vai ser extraída das
células com violência, deformando-as e alterando as posições internas dos organitos
(cada um dos elementos que constituem a célula), ou mesmo destruindo-os. É
preciso, portanto, uma série de banhos com concentrações crescentes.
Fonte da imagem:
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/processo-de-inclusao-em-parafina/
Fonte da imagem:
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/observacao-de-celulas-da-mucosa-bucal-mic
roscopio/
INCLUSÃO (O uso da parafina é o mais comum)
● É necessário que o histologista inclua os tecidos em um meio apropriado e realize
cortes finos, para que seja possível distinguir as células de um tecido da matriz
extracelular. A Parafina é um meio de inclusão em microscopia óptica. O tecido
deve ser colocado em um recipiente que contenha parafina, para que o mesmo seja
totalmente infiltrado. Após ser impregnado com a parafina, o tecido deve ser
colocado em outro recipiente com parafina fundida, até que haja um bloco de
parafina contendo o tecido.
● A inclusão em parafina é precedida pelo uso de substâncias químicas como o xilol,
este miscível tanto em álcool quanto em parafina. Após a remoção do álcool, o
tecido passa por uma infiltração em parafina líquida, esta mantida em estufa a 56°C
(ponto de fusão) e posteriormente o mesmo é transferido para o molde contendo
parafina líquida. Em poucos minutos a parafina endurecerá e obter-se-á portanto, o
"bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da
inclusão em resina como o glicol metacrilato, o tecido é infiltrado com uma resina de
infiltração por uma noite, e então incluído no molde contendo a resina ainda líquida,
sendo que esta endurece após algumas horas. Como no caso da parafina, após o
endurecimento, obtém-se um bloco de resina que contém o fragmento de tecido em
seu interior. Os blocos serão a partir desta etapa levados para a microtomia e
consequente obtenção das secções, que serão então coletadas em lâminas de
vidro. No caso de inclusão em parafina, após a microtomia, o tecido é tratado com
xilol novamente para remoção da parafina e rehidratado, para que possa ser
submetido à coloração
Fonte das imagens:
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/processo-de-inclusao-em-parafina/
MICROTOMIA (Corte)
A microtomia é realizada após ter sido removido o excesso em material de inclusão. A
mesma é efetuada com a utilização de um micrótomo, um aparelho que faz cortes
microscópicos, variando geralmente de 5 à 10 μm (micrômetros) de espessura, em
pequenas amostras de material biológico (geralmente tecidos) em blocos de resina
específica (parafina) para análise em microscópio óptico. Além disso, a microtomia pode
ser efetuada em espécimes congelados, sendo os blocos de tecidocortados a -20º C com
uma lâmina de aço pré-resfriada. Os cortes são colocados em lâminas de vidro
pré-resfriadas e corados com corantes.
Fonte da imagem:
http://materiais.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/histoltecnicas.htm
http://materiais.dbio.uevora.pt/jaraujo/biocel/histoltecnicas.htm
MONTAGEM E COLORAÇÃO (Precisa retirar a parafina e reidratar o material para a
coloração)
● Os cortes são cortados com uma lâmina de aço e montados em lâminas de vidro
revestidas com adesivo. Geralmente, muitos constituintes dos tecidos têm
praticamente a mesma densidade óptica. Então, esses constituintes precisam ser
corados para a microscopia óptica. Nesse tipo de microscopia, são utilizados
geralmente corantes solúveis em água. Logo, a parafina deve ser removida do corte
e o tecido é reidratado e corado. Após a coloração, o corte é desidratado para
permitir que uma lamínula seja afixada, utilizando um meio de montagem adequado.
A lamínula protege o tecido de danos e é necessária para a observação do corte ao
microscópio.
Os corantes podem ser divididos em três classes:
* Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos da célula
* Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular
* Sais metálicos que precipitam nos tecidos formando depósitos de metal
● Os corantes servem para facilitar a visualização de diferentes estruturas nas células
● A maioria dos elementos que constituem os tecidos é naturalmente incolor e os
respectivos índices de refracção não se afastam muito do da água. Para que eles se
tornem visíveis ao microscópio fotónico, recorre-se à coloração quer dos
componentes protéicos das estruturas, quer das inclusões celulares de natureza
química diversa. Alguns dos corantes mais comuns são a hematoxilina, a floxina e o
verde luz
Fonte das imagens:
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/observacao-de-celulas-da-mucosa-bucal-microscopi
o/
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/observacao-de-celulas-da-mucosa-bucal-microscopio/
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/observacao-de-celulas-da-mucosa-bucal-microscopio/
Fontes:
● https://medicinauesbjq.wixsite.com/histologia/single-post/2015/12/06/No%C3%A7%C3%
B5es-sobre-Prepara%C3%A7%C3%A3o-de-L%C3%A2minas-Histol%C3%B3gicas
● http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm
● http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/processo-de-inclusao-em-parafina/
● https://www.ehow.com.br/procedimento-calibrar-paquimetro-digital-fatos_121284/
https://medicinauesbjq.wixsite.com/histologia/single-post/2015/12/06/No%C3%A7%C3%B5es-sobre-Prepara%C3%A7%C3%A3o-de-L%C3%A2minas-Histol%C3%B3gicas
https://medicinauesbjq.wixsite.com/histologia/single-post/2015/12/06/No%C3%A7%C3%B5es-sobre-Prepara%C3%A7%C3%A3o-de-L%C3%A2minas-Histol%C3%B3gicas
http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/processo-de-inclusao-em-parafina/