Ascaris suum

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Estágios iniciais de Ascaris Suum induzem a inflamação das vias aéreas e a hiperatividade em ratos modelos
Antônio de Carvalho Júnior - 2011.1
RESUMO
	Alterações pulmonares inflamatórias e funcionais que ocorrem em murinos após a infecção com 2.500 ovos de Ascaris suum foram estudadas nesse trabalho. Um fluxo sequencial de neutrófilos, células mononucleares e eosinófilos ocorreram em vias aéreas concomitantemente com migrações de larvas do fígado para o pulmão. Uma análise histológica mostrou uma hemorragia intraalveolar grave no auge da migração larval (dia 8) e a célula no auge do infiltrado inflamatório (dia 14). Ascaris L3 foram encontradas em espaços alveolares e bronquíolos no dia 8. O numero de eosinófilos foi elevado no sangue nos dias 8 e 14. O pico de afluência de eosinófilos no pulmão foi no dia 14. A resposta de anticorpos contra antígenos de ovos e larvas consistiu principalmente de IgG1 e IgM, e também de IgE e
IgG1 anafilática, que cross-reagiram com antígenos do verme adulto. Níveis de IgE total foram substancialmente elevados durante a infecção. A mediçao de parametros mecanicos pulmonares mostrou uma hiperatividade das vias aéreas em camundongos infectados. 
	Em conclusao, os modelos de murinos de A. Suum Imita a infecçao de parametros a-Th2, que ocorre em porcos e seres humanos e pode ser usada para analisar as propriedades imunes destes helmintos.
INTRODUÇÃO
	Infecções por parasitas podem ser a causa mais comum de doenças crônicas em seres humanos. Em países mais pobres há mais pessoas infectadas do que não infectados. Infeçções gastrointestinais por helmintos são extremamente difundidas e contribuiem significativamente para a morbidade e mortalidade entre os seres humanos e animais nos países em desenvolvimento. Entre esses helmintos, o mais prevalente em seres humanos é o Ascaris lumbricoides. Estima-se que cerca de 1,5 bilhão de pessoas estão infectadas no mundo, principalmente em regioes tropicais e mesmo essa infecção sendo crônica e não fatal, é associada com morbidade significativa. Além disso, outras espécies de Ascaris, como o A. suum, oferecem importantes informações sobre a biologia de outros nematóides Ascaris, especiamente a humana. 
	Ascaris suum é uma lombriga intestinal de suínos e seu ciclo de vida é idêntico ao do
A. lumbricoides. Por isso, é um modelo útil para o estudo deste importante parasita humano. No camundongo, o seu comportamento de migração larval no início imita o comportamento em suínos. Resumidamente, os ovos eclodem no intestino e as larvas penetram na parede do ceco do intestino superior movendo-se para o fígado, provavelmente, pela corrente sanguinea venosa. Posteriormente, há avanço das larvas para o pulmão onde elas se desenvolvem, penetram no espaço alveolar e migram para a traquéia onde são engolidas outra vez, sendo eliminadas nas fezes. 
	Evidências de que outras cepas de A. suum infectam seres humanos, associados à longevidade dos ovos de Ascaris, representam uma importante questão de saúde pública por causa do amplo uso de dejetos suínos como fertilizantes, principalmente nos EUA e na Europa. É importante ressaltar, que a patogenicidade da doença e a migração das larvas causam grandes perdas economicas de gados afetados. 
	Infecções por Ascaris suum e por outros helmintos, são caracterizadas por hiperplasia de mastócitos, eosinofilia e grandes niveis de IgE circulantes. Níveis elevados de IgE anti-parasita e eosinifilia são associadas com o aumento da resistência às infecções por helmintos e de sua patogenicidade. 
	Uma vez que as larvas migratórias passam pelo pulmão, decidimos analisar as alterações provocadas por estas nessr orgão. Este trabalho analisa as infecções e alteraçoes fisiológicas que ocorrem no pulmão murino após a infecção com ovos infectantes de A. suum. Para isso, determinamos o numero de celulas inflamatórias em BAL (lavado broncoalveolar) e o número de larvas presentes em dias diferentes após a infecção. Medimos também os isotipos diferentes, bem como os anticorpos anafiláticos no plasma de camundongos infectados nos dias 8, 14 e 21. Além disso, verificamos a função pulmonar dos animais, por meio de medições da condutância dinâmica pulmonar duas semanas após a infecção.
MATERIAIS E MÉTODOS
ANIMAIS PARA O EXPERIMENTO
	Camundongos BALB/c, pesando 18-22 g, foram utilizados para este estudo. Ratos de três meses de idade, da raça Wistar foram
usado para reações cutâneas passivas anafilática. Os animais
estavam em um ciclo 12h:12h claro-escuro, com temperatura controlada. Eles receberam água e comida uniformemente. 
PROTOCOLO DE INFECÇÃO
	Os ovos de Ascaris summ foram coletados do útero do verme e cultivados ao estágio infeccioso durante 4-5 semanas, em temperatura ambiente e sob proteção da luz. Grupos de 4-5 camundongos foram inoculados por via intragastrica com uma suspensão contendo 2.500 ovos infectantes. 
RECUPERAÇÃO DE LARVAS DOS PULMÕES
	A recuperação foi feita como descrita em protocolo.
LAVADO BRONCO ALVEOLAR (LBA)
.
. (NAO VOU FAZER O RESTO -> NÃO É IMPORTANTE!!!!!!!!!)
RESULTADOS
INFECÇÃO POR ASCARIS SUUM CAUSA UM AUMENTO DO INFLUXO DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS NOS PULMÕES E NAS VIAS AÉREAS
	A fim de determinar a inflência do A. suum na infecção pulmonar, que é caracterizada pela cinética de migração das células para os pulmões e vias aéreas durante 49 dias após a infecção. Esses resultados foram comparados com a cinética das larvas migrando para os pulomões. Em camundongos BALB/c infectados com 2.500 ovos, o número de larvas L3 encontradas nos pulmões foi de 79,44 ± 25,56 no primeiro dia e declinou quase para zero até o 14º dia (dados não mostrados).O pico da migração larval foi seguido por uma intensa inflamação local. O número total de células no LBA (FIG 1a) aumentou significativamente após 10 dias, atingiu um máximo no 14º dia e caiu para os níveis de controle após 4 semanas. A contagem de células diferenciais (FIG 1b) um primeiro influxo de neutrófilos, seguido por células mononucleares e depois por eosinófilos em BAL. O maior numero de cada um desses tipos celulares foram encontrados no 10º, 14º e 21º dias, respectivamente. 
	Para investigar o acúmulo de eosinófilos nos tecidos pulmonares, a presença de EPO (peroxidase eosinofílica) foi avaliada nos dias 8, 14 e 21 (FIG 2). A atividade de EPO foi aumentada nos pulmões infectados do 8º dia ate o 21º dia, mas no 14º dia foi significativamente maior.
	A TABELA 1 também mostra mais eosinófilos circulantes no sangue nos dias 8 e 14 após a infecção, sendo relacionados com o pico de eosinófilos no tecido pulmonar e no liquido de LBA. O conteúdo de Células mononucleares e neutrófilos permaneceram inalteradas.
	A análise histológica detalhada do pulmão de camundongos infectados mostrou uma hemorragia intra-alveolar severa e um infiltrado inflamatório em torno dos bronquíolos no dia 8 pós-infecção (Figura 3b).
ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS EM CAMUNDONGOS INFECTADOS
	O perfil de isotipos de anticorpos contra o verme adulto, ovo e antígenos das larvas foram determinados nos dias 8, 14 e 21 após infecçao pelos ovos de helmintos. Conforme figura 4, IgG1 e anticorpos IgM reagiram com antigenos de larvas e ovos, sendo IgG1 mais reativo à larva L3. Uma grande resposta IgM foi observada durante todo o processo de infecçao. Todos esses anticorpos possuem entao, uma grande afinidade por determinados tiposde antigenos das larvas/ovos do verme.
INFECÇÃO POR ASCARIS SUUM REGULA POSITIVAMENTE A SECREÇAO DE ANTICORPOS ANAFILÁTICOS
	Nos plasmas analisados, os niveis de anticorpos anafilaticos foram medidos por ELISA (IgE total) e pelo PCA (antigenos especificos de IgE e IgG1 anafilaticos). A quantidade
de IgE total subiu de <0,04 mg/mL nos camundongos não-infectados para
6,87 ± 0,49 mcg/mL em camundongos infectados no dia 8; 8,59 ± 1,01 mg/mL no dia 14; e 21,66 ± 0,11 mcg/mL no dia 21. A mesma coisa foi observada em antigenos especifico-IgE (FIG 5a) e anticorpos anafilaticos IgG1 (FIG 5b).
A HIPER-ATIVIDADE DAS VIAS AÉREAS É AUMENTADA EM CAMUNDONGOS INFECTADOSPara medir a influência da infecção por A. suum pulmonar em funçao da hiper-atividade das vias aéreas, foi avaliado a condutância (GRS) e a complacência dinâmica (CRs) das mesmas. O efeito da infecção de neumatóides sobre os parâmetros mecânicos do trato respiratório foi avaliado por uma curva de dosagem de resposta à metacolina, 14 dias após a infecção pelos ovos infectantes. Os valores de CRs, que representa a capacidade de resposta das vias aéreas periféricas e, GRs, que representa a responsividade das vias aéreas centrais, foram obtidos por volume do fluxo de ar e por dados referentes às pressões. Os resultados apresentados na FIG 6 são expressos como logaritmos da dose de meticolina que reduziu para 40% e 70% dos valores basais de CRs e GRs, respectivamente. Em camundongos BALB/c infectados menores doses do agonista reduziam CRs (FIG 6a) e GRs (FIG 6b) em comparação a grupos controle, indicando uma resposta aguda quando o agonista era administrado.
DISCUSSÃO
	A capacidade do nematoide em modificar a resposta imune do hospedeiro tem sido uma área de grande interesse de pesquisa. Uma tentativa de se compreender a relação desses parasitas e seus hospedeiros poderia elucidar os mecanismos de regulação imune dessa interação, contribuindo para o desenvolvimento de vacinas e terapêuticos em áreas onde essas infecções são endêmicas. Neste estudo, analisamos as resposta a resposta de anticorpos e o dano pulmonar induzido por infecção de A. suum em relação ao influxo de células inflamatórias para os pulmões e as alterações fisiológicas desse órgão. 
	Nossos dados mostram que, concomitantemente com a migração de larvas L3 para os pulmões, leucócitos infiltrantes, que consistia de células mononucleares e polimorfonucleares, foram encontradas no tecido pulmonar e no LBA. O aumento de neutrófilos e os números de eosinófilos no LBA de camundongos infectados foi muito maior (2.800 vezes) em comparação a camundongos não infectados, enquanto o numero de células mononucleares aumentou somente duas vezes. Eosinófilos circulantes eram o único tipo de leucócito, que aumentou significativamente durante a segunda semana de infecção. Além disso, a histologia demonstrou que uma extensão hemorragia evidente que acompanhou o pico de migração das larvas no dia 8. Hemorragias também foram encontradas em pulmões de cães, cobaias, ratos e seres humanos infectados com outros tipos de helmintos. 
	Neste modelo, o pico de eosinófilos no tecido pulmonar infectado foi no 14º dia, como demonstrado pelos maiores níveis de EPO presentes nesse momento, seguido pela migração de eosinófilos para o lúmen das vias aéreas (pico no 21º dia em BAL). EPO é um dos principais componentes dos grânulos de eosinófilos. A eosinofilia apresentada é uma característica importante de infecções por helmintos, principalmente durante os estágios invasivos dos mesmos. A presença de eosinófilos nos animais infectados por helmintos está associada com a produção de IgE e uma hipersensibilidade, indicando a ativação do complexo Th2. Neste estudo, os níveis séricos de IgE, bem como de IgE-ASC específicos e IgG1-anafilatico também aumentou substancialmente até o 21º dia. Estes resultados demonstram quem os primeiros estágios larvais desenvolvidos nos modelos murinos contem alérgenos capazes induzir anticorpos anafiláticos que reagem de maneira cruzada com alergenos de vermes adultos. Assim, temos caracterizada uma proteína alergênica de vermes adultos que também está presente em ovos e larvas L2 e L3. 
	Células Th2, inflamação eosinofilica e níveis elevados de IgE são, na sua maioria, associados à hiperatividade das vias aéreas por estímulos específicos ou inespecíficos. Como demonstrado, Os camundongos infectados por Ascaris foram hiper-reativos a um broncoconstritor (metacolina), mostrando uma redução de parâmetros mecânicos, como condutância e complacência dinâmica. Essas redução é muito provável pela presença de anticorpos anafiláticos induzidos por larvas. 
	Além de IgE e IgG1, o isotipo predominantemente produzido em resposta de anticorpos contra infecção por A. suum foi IgM. Segundo Crandall & Crandall, há de 10 a 20 vezes um aumentos nas concentrações séricas de IgM durante a segunda semana de infecção por A. suum em camundongos BALB/c. Estudos por inibição de IgM mostraram que este tem uma especificidade à fosforicolina. O papel protetor (defesa) do IgM contra larvas de Strongyloides stercoralis tem sido demonstrado em ratos suprimidos de células B, células B1 ou IgM circulantes. Mas, pelo menos na infecção filarial, esta proteção por IgM não parece ser dirigida contra fosforilcolina. Nada foi publicado com relação a outros nematóides.
	Outros resultados interessantes que obtivemos no nosso camundongo infectado por Ascaris foi à supressão do anticorpo relacionado à resposta a um antígeno não relacionado e a migração dos leucócitos em função de uma resposta inflamatória induzida pelo lipopolissacarídeo bacteriano. Tem sido proposto que as infecções por helmintos podem proteger das doenças alérgicas, provocando, em alguns modelos experimentais, um down-regulation de CD4, CD25, FoxP3 e células T induzidas por alergenos de patologias pulmonares. Estudos epidemiológicos, no entanto, apresentam resultados conflitantes. Lynch e colaboradores relataram que baixos níveis de infecção intestinal por helmintos pode contribuir para os sintomas clínicos da asma em uma situação endêmica, por meio de uma resposta ao parasita e/ou uma potencialização da resposta à alergenos ambientais. Nossos dados, em conjunto, mostram que o modelo murino de infecção por Ascaris é um instrumento adequado para aprofundar a análise da capacidade imunomoduladora dos helmintos.
 
Figure 1 Kinetics of airway inflammation in Ascaris suum-infected
mice. BALB/c mice were infected with 2500 infective eggs, and
total (a) and differential (b) cell migration were analysed in the
BAL fluid during the infection. Data represent the mean } SEM
for four mice/group. The results are representative of two repeats.
*P < 0·05 compared with non-infected group (day 0).
Figure 2 Measurement of EPO activity in lung tissue from Ascaris
suum-infected mice. BALB/c mice were infected orally with 2500
infective eggs and sacrificed 8, 14 or 21 days later. The EPO activity
was determined in the homogenate of the lung tissue. The results
represent the mean } SEM absorbance for five animals/group.
*P < 0·05 compared with non-infected group (day 0). #P < 0·05
compared with other experimental groups. The results are
representative of two repeats.
Figure 3 Histological alterations of lung
tissue after Ascaris suum infection.
Representative lung section from normal
(a) or infected mice after 8 (b) or 14 days (c),
showing severe intra-alveolar haemorrhage
(b) and intense inflammatory cell infiltration
(c). Larvae in the alveolar space on day 8 of
infection (d). H/E staining.
Figure 4 Profile of antibody production in Ascaris suum-infected
mice. ELISA plates were coated with extracts from adult worms
(ASC), eggs, L1, L2 and L3 larvae, and incubated with plasma from
infected mice obtained after 8 (a), 14 (b) or 21 (c) days, followed by
rat mAb against mouse isotypes. Data represent the increase in
absorbance of pooled infected plasma above naive plasma at
1 : 20 dilution (five animals/group). The results are representative
of three repeats
Figure 5 Anaphylactic antibody production in Ascaris suuminfected
mice. IgE (a) and anaphylactic IgG1 (b) antibody titres
were obtained by PCA in rats and mice, respectively, sensitized
with plasma from infected mice and challenged with ASC. The
PCA titre represents the highest dilution of pooled plasma that
induced a positive reaction (> 5 mm of diameter) in a triplicate
test (dotted line, detection limit of the assay). The results are
representative of three repeats.
Figure 6 Effect of Ascaris suum infection on airway responsiveness.
Two weeks after infection, mice were intravenously injected with
different doses of methacoline and results expressedas doses
required to reduce dynamic compliance (Crs) (a) to 40%, and
conductance (Grs) (b) to 70% of their control values. Horizontal
bars represent the mean values. *P < 0·01 compared with
non-infected mice. The results are representative of two repeats.