Extração do RNA e DNA - Biologia molecular

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Extração do RNA e DNA
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Etapas
O que é?
É uma técnica que serve para fazer a identificação de genes que possuam
susceptibilidade e/ou resistência a uma determinada doença.
De onde extrair?
→ Pele → Saliva → Muco → Sangue
Rompimento da parede celular (plantas e bactérias)1.
 2. Lise das membranas plasmáticas
 → Lise mecânica: Quebra feita manualmente através de pistilo
 → Lise química: É utilizado um tampão de lise
 - Tris: Mantém o pH da solução e permeabiliza a membrana celular; 
 - EDTA: Agente quelante que bloqueia a atividade de nucleases (RNAses e DNAses), 
 para evitar que estas enzimas degradem o conteúdo genético;
 - SDS: Detergente que ajuda na desnaturação da membrana celular e de proteínas; 
 - NaCl: Previne a desnaturação do RNA/DNA; 
 - MgCl2: Impede a mistura do RNA/DNA com outras organelas.
 → Lise enzimática
 3. Remoção das proteínas e contaminantes
 → Fenol
 → Clorofórmio
 → Trizol
 4. Centrifugação
 → Fase aquosa/sobrenadante: Parte de cima
 → Fase orgânica/precipitado: Parte de baixo
5. Recuperação do RNA/DNA - Precipitação dos ácidos nucléicos
- O RNA/DNA é uma molécula polar com carga negativa. Por ser polar, são solúveis
 em água;
- Então é necessário que as cargas negativas sejam neutralizadas e o RNA/DNA
 se torne apolar, com isso é acrescentado o sal;
- Depois é acrescentado o álcool (etanol ou isopropanol) que possui grupos polar e
 apolar. Interage com a água e protege o RNA/DNA da água. Isso é necessário para 
 que ocorra a precipitação do material genético;
- Depois da precipitação as amostras são submetidas a centrifugação e será formado
 um corpo de fundo chamado ''pellet''
6. Eluição
→ Tampão TE
→ Água ultrapura
→ Água DEPC
7. Adição de enzimas
- Caso se queira obter DNA do material genético, é colocada a enzima RNAse afim de
degradar todos os RNA's presentes na amostra;
- Caso se queira obter RNA do material genético, é colocada a enzima DNAse afim de
degradar todos os DNA's presentes na amostra.
8. Armazenamento 
→ DNA: É armazenado a -10°C,pois é mais estável que o RNA.
→ RNA: É armazenado a -70°C.
9. Quantificação e análise de integridade do material genético extraído
→ Nanodrop: Baseado na espectofotometria. Faz a leitura da absorbância em vários
 comprimentos de onde;
→ Qibit: Baseado na florometria. Utiliza corantes fluorescentes específicos que 
 emitem fluorescência.
→ Gel de qualidade: Separa as macromoléculas como RNA/DNA ou proteínas em 
 uma matriz de agarose. Visualizar as moléculas de RNA ou DNA.
→ Fio de cabelo
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Extração de RNA
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Como é feita?
A primeira etapa para realizar a extração do RNA (tanto o RNA do núcleo quanto o do
citoplasma celular), é lesar as membranas: a plasmática e a nuclear. Esse processo é feito
através da adição de detergente, uma vez que o detergente é um componente polar capaz de
promover uma quebra na bicamada fosfolipídica. Com isso iremos ‘’sonicar’’, ou seja,
quebrar a estrutura da célula e promover a lise das membranas. O detergente que é
normalmente utilizado em laboratórios é o SDS;
1.
 1.1 A partir do momento que ocorre a lise, a célula começa a entrar em morte celular, já que
 suas estruturas estão sendo degradadas. Desse modo, é necessário desnaturar as RNAses
 para impedir a sua atividade na célula e impedir que ela dane o RNA de estudo, com isso é
 adicionada uma substância chamada de ‘’DEPC’’(dietilpirocarbonato), que diminui a
 contaminação com RNAses das soluções;
 2. A segunda etapa é fazer a adição de fenol, com a intenção de fazer com que o RNA se
 desvincule de proteínas e outras partes orgânicas que podem estar aderidas a ele, fazendo
 com que obtenhamos o RNA em sua forma mais pura. Após isso, realizamos a centrifugação
 para separar em duas partes: o sobrenadante (RNA + clorofórmio) e o precipitado (partes
 orgânicas + fenol);
 3. Como o fenol é agressivo e o RNA é bastante delicado, qualquer coisa pode causar um dano
 nele. Com isso, a terceira etapa é realizar a adição de clorofórmio para retirar o excesso de
 fenol do meio celular, na intenção de impedir a desnaturação do RNA;
 4. A quarta etapa é adicionar o isopropanol para fazer com que o RNA deixe de ser um
 sobrenadante e vá para o fundo do tubo, ou seja, se torne um precipitado;
 5. Caso queira ressuspender esse RNA e deixe ele como sobrenadante novamente, é só retirar
 o isopropanol e ressuspender em água.
Na imagem foi colocado o trizol, que é a junção do detergente mais o fenol.
Quantificação
→ Após a extração, é necessário identificar o quanto de RNA tem naquela
 amostra e, para isso, fazemos o uso do espectofotômetro;
→ Também é nesse aparelho que verificamos a pureza do RNA para poder
 prosseguir com os seguintes processos;
→ A leitura a260nm permite calcular a concentração de RNA:
 OD=1 equivale a aproximadamente 40µg/ml de RNA fita simples. A pureza do 
 RNA pode ser avaliada pela proporção 260/280nm que deve ser entre 1.8/2.0. 
 Se for abaixo deste valor, indica contaminação do RNA com proteína e fenol.
Fator de diluição: Volume final / volume da amostra
Concentração de RNA no tubo
Quantidade total de RNA no tubo: Concentração do RNA x volume do tubo
Exemplo:
1°) Sabendo-se que se colocou 1µl de RNA para 79µl de água e a absorbância a
260nm da amostra foi de 0,298, qual a concentração e quantidade total de RNA
no tubo, sabendo-se que o volume deste é de 30µl? 
Explicação: Fez todo o processo de extração e ressuspendeu em 30µl de água. Tirou
1um e colocou 79µl e foi ver a absorbância.
 1µl da amostra + 79µl de água= 80 
 80/1= 80x
 1-----------------40µg/ml → 0,04µg/µL
 0,298------------ X
 X= 0,298 x 0,04 x 80 (fator de diluição)
 X= 0,9536µg/µL
 RNA= 0,9536 x 30µL
 RNA= 28,608µg
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Extração de RNA
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Análise do Rna
Gel de agarose - 1% de agarose com 2.2M de formaldeído
 - Para confirmar a pureza desse RNA, podemos usar o gel de agarose;
 - Coloca o RNA em um pocinho e faz correr a lâmina, fazendo com que seja
 extraído todos os tipos de RNA (rRNA, mRNA,tRNA) de acordo com seu peso;
 - Encontrando essas bandas, é um indicativo de que o RNA está íntegro e sua
 estrutura foi preservada.
- Banda 28 S: Subunidade maior do rRNA
- Banda 18 S: Subunidade menor do rRNA
- Banda 5 S: mRNA
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