PCR - Biologia molecular

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PCR - Reação em Cadeia de Polimerase
BioMolBioMol
O que é?
Etapas
É um método in vitro de amplificação do DNA.
O que precisa?
Desnaturação
- Tampão;
- Temperatura: A temperatura é aumentada para 95°C afim de romper as pontes
 de hidrogênio e dissociar a dupla fita de DNA, formando 2 fitas simples
Anelamento
- Baixamos a temperatura de 95°C para mais ou menos 60°C, tornando o
 ambiente estável para promover as ligações de hidrogênio;
- Os primers com sequências específicas do fragmento alvo que queremos
 amplificar são adicionados e se anelam as regiões que eles são 
 complementares. 
Extensão
- Aumenta a temperatura de 60°C para 72°C; 
- A TAC polimerase é uma enzima que é mais resistente a se associa ao primer
para começar a adicionar nucleotídeos a fita de DNA;
- A TAC polimerase só vai adicionar nucleotídeos na fita molde no sentido
 5'-3';
- Após fazer a complementariedade, teremos 2 novas fitas;
- Se caso repetirmos esse ciclo de 3 etapas inúmeras vezes, iremos gerar
 várias moléculas de DNA idênticas e o seu aumento será exponencial.
Quem faz isso?
Termociclador: Responsável por fazer os
ajustes de temperatura para que todas as
etapas ocorram.
Características
- PCR permite que um fragmento específico de DNA seja amplificado (copiado)
bilhões de vezes;
- DNA polimerase termo estável (TACpolimerase) junto com os termocicladores
foram os responsáveis pela automatização da técnica;
- O produto da PCR deve ser processado para que seja possível analisá-lo;
- Muitas aplicações são realizadas por meio de PCR e quase todas as técnicas
de biologia molecular utilizam PCR ou alguma variação dela ao longo de seu
fluxo de trabalho.
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PCR - Reação em Cadeia de Polimerase
BioMolBioMol
- É a separação por tamanho através da migração de cargas que vão do polo
negativo para o polo positivo baseada no peso molecular dos componentes que
irão compor a amostra;
- Isso ocorre porque o gel de agarose ou poliacrilamida é uma espécie de
malha capaz de separar os componentes a partir do seu tamanho/peso
molecular e essas partículas irão 'correr', por meio da ativação de uma
geração de corrente elétrica, do polo negativo para o polo positivo. As mais
leves e menores tem uma maior facilidade de passar por essa malha, enquanto
as mais pesadas e maiores tem uma maior dificuldade e acabam por não
alcançar uma distância muito longa;
- Assim, podemos separar componentes do DNA como: RNA's, DNA's,
proteínas e etc.
- As amostras são colocadas em pocinhos e há uma escada de DNA que dá
uma medida para sabermos quantos pares de base (pb) há naquela banda.
Eletroforese Exemplo: Temumacorrida a longa distância e tem 3 corredores. Um gordo, um
de peso médio e um magro. A resistência pra corrida aumenta do gordo até o
magro.
Quando o sinal dispara, os participantes começam a correr. O magro consegue
atingir uma lonoga distância, já que teve um maior preparamento físico pra
isso, o médio para no meio da corrida e o gordo não consegue coorer por muito
tempo pois não estava preparado o suficiente para a maratona.
Aplicações
- Diagnóstico rápido de doenças infecciosas;
- Sequenciamento de genomas;
- Clone, mutações, engenharia genética;
- Testes de paternidade;
- Medicina forense;
- Perícia criminal