Apostila de Microbiologia

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Campus Centro-Oeste Dona Lindu 
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
Jaqueline Maria Siqueira Ferreira 
 
 
 
 
 
 
 
Divinópolis - MG 
 2 
 1. NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
- É obrigatório o uso do avental e pelo menos uma caneta de retroprojetor. 
- Não colocar na bancada de trabalho do laboratório bolsas, material escolar, livros, celulares e 
outros objetos. Coloque-os no armário. 
- Retirar todos os acessórios pessoais como brincos grandes, pulseiras, etc. 
- Desinfetar com etanol 70% o local de trabalho antes e ao término das manipulações. 
- A altura do assento, diante da mesa de trabalho, deverá ser regulada de modo que os antebraços 
do manipulador repousem facilmente estendidos sobre a mesa. 
- Não fumar, nem levar à boca nenhum material, para evitar a contaminação do operador. 
- É proibido o consumo de alimentos e bebidas dentro do laboratório, inclusive chicletes e balas. 
- Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen). Verificar se não existem substâncias 
inflamáveis por perto. 
- Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 
- Os tubos de ensaio e as placas de Petri com meios de cultura, inclusive aqueles com crescimento 
de microorganismos, só poderão ser abertos nas proximidades da chama para evitar 
contaminação. 
- Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável. 
- Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado. NUNCA deve ser deixado sobre 
a bancada ou sobre a pia. 
- Seguir as normas de uso dos aparelhos. 
- Cada aluno é responsável pelo material que receber. 
- Ao final dos trabalhos práticos, efetuar cuidadosamente limpeza das mãos (etanol 70%) 
ou com água e sabão. 
 3 
 
AULA 1 
PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE 
CULTURA 
_____/_____/_____ 
 
1. INTRODUÇÃO 
O cultivo de microrganismos em laboratórios requer a formulação de meios de cultura e o 
estabelecimento de condições que favoreçam o seu desenvolvimento fora de seu habitat natural. Os 
meios de cultura devem proporcionar todos os elementos que compõem a célula: 
Carbono, Nitrogênio, Fósforo, Enxofre, elementos metálicos (Ca++, 
Zn++,Na++,Cu++,Mn++,Mg++ e Fe++), vitaminas e água. Os microrganismos diferem quanto as suas 
exigências nutricionais. Alguns são capazes de se desenvolverem em meios inteiramente minerais e 
utilizarem CO2 como fonte de carbono (autotróficos). Outros requerem compostos orgânicos como fonte 
de carbono (heterotróficos). 
Existem meios naturais como infusão de batata, sangue e leite, cuja composição química não 
é precisamente conhecida. Existem meios sintéticos com componentes químicos puros, orgânicos e ou 
inorgânicos, cujas composições podem ser delineadas. Existem algumas denominações especiais para os 
meios de cultura que são relacionadas a sua composição ou função. Dependendo da finalidade a que se 
destinam, os meios de cultura podem ser preparações líquidas usadas em estudos de crescimento, 
fermentação e produção de biomassa; meios sólidos, úteis para contagem e isolamento de 
microrganismos; ou semi-sólidos utilizados para detecção de placas de lise em culturas bacterianas 
infectadas por vírus ou para estocagem da cultura. O agente solidificante geralmente é o ágar. Para meios 
semi-sólidos utiliza-se 0,8% (m/v) de ágar e para meios sólidos 1,5% (m/v). De maneira geral podemos 
classificar os meios quanto a sua composição em: meio mímimo (MM), meio diferencial, meio de 
enriquecimento e meio seletivo. 
Além dos requerimentos nutricionais, fatores físicos tais como temperatura, presença de 
oxigênio, atmosfera de incubação e pH, estabelecem condições ótimas de crescimento microbiano. 
 
Esterilização: Processo de destruição de todas as formas de vida microscópica. Um objeto 
estéril, no sentido microbiológico, está completamente livre de germes vivos. Os termos estéril, 
esterilizar e esterilização, por isso, referem-se à ausência total ou a destruição de todos os microrganismo 
e não devem ser usados com sentido relativo. Um objeto ou substância estão ou não estéreis, jamais 
poderão estar meio – estéreis ou quase estéreis. As relações tempo/temperatura e volume/área do material 
ou meio a ser esterilizado, bem como a eficiência de penetração ou difusão do agente letal, devem ser 
consideradas na definição do processo de esterilização. 
Assepsia: É um conjunto de processos (técnicas) utilizados para impedir a penetração de 
germes em local que não os contenha. 
Flambagem: A maneira mais simples de se esterilizar um instrumento é aquecê-lo 
diretamente até o rubro em uma chama. Na técnica bacteriológica utiliza-se correntemente a flambagem 
na chama do bico de Bunsen (bico de gás) para esterilizar a alça de inoculação ou semeadura 
bacteriológica, a ponta das pipetas, as bocas dos tubos de ensaio e/ou garrafas, as bocas dos balões etc. O 
processo de flambagem, quando da abertura e do fechamento de frascos e/ou ambos contendo culturas 
microbianas, ocorre atrás da chama de bico de Bunsen, isto é, numa área isenta de microrganismos 
(estéril). 
 
2. OBJETIVOS 
• Preparar meios de cultura. 
• Demonstração e treinamento em grupo da técnica de esterilização em autoclave e outros 
equipamentos 
• Demonstração e treinamento em grupo da técnica de filtração, através da utilização de filtros. 
 
 
3. MATERIAIS 
Reagentes: Meios de cultura, água destilada, álcool 70%. 
 4 
Equipamento: Balança, banho-maria, autoclave, estufa de crescimento 
Utensílios: Placas de Petri, tubos de ensaio, Erlenmeyer, bastão de vidro, filtro Millipore, espátulas. 
 
4. PROCEDIMENTOS 
4.1 - Preparo dos meios de cultura: 
 
Meio sólido em placa 
1. Pesar o meio de cultura ou seus componentes separadamente. 
2. Colocar tudo em um Erlenmeyer. 
3. Pesar por último o ágar e colocar no Erlenmeyer. 
4. Adicionar um pouco de água destilada e aquecer em banho-maria para dissolução dos 
componentes e do ágar. 
5. Completar o volume com o restante da água destilada. 
6. Misturar com bastão de vidro. 
7. Tampar com algodão. 
8. Colocar um capuz de papel alumínio. 
9. Autoclavar a 120ºC 1 atm por 20 minutos. 
10. Abrir o Erlenmeyer próximo ao bico de Bunsen e colocar em torno de 20 ml de meio de cultura 
por placa de Petri. 
11. Manter a placa fechada sobre o balcão, até que o meio de cultura se solidifique. 
12. Compostos termolábeis devem ser esterilizados por filtração e só adicionados ao meio de cultura 
quando o mesmo estiver ao redor de 45ºC. 
 
Meio sólido em tubo 
1. Repetir procedimentos 1 a 6 do item anterior 
2. Colocar o meio em tubos de ensaio. 
3. Tampar os tubos com algodão. 
4. Cobrir com papel alumínio. 
5. Autoclavar a 120ºC. 1 atm por 20 minutos. 
6. Inclinar os tubos sobre a bancada para que o meio solidifique inclinado. 
 
Meio líquido em tubo 
1. Pesar o meio de cultura. 
2. Colocar em Erlenmeyer. 
3. Adicionar um pouco de água destilada para dissolver. 
4. Completar o volume com o restante da água destilada. 
5. Misturar com bastão de vidro. 
6. Colocar em tubos de ensaio o volume que se deseja. 
7. Tampar com algodão. 
8. Cobrir com papel alumínio. 
9. Autoclavar por 20 minutos a 120ºC 1 atm de pressão. 
 
4.2. Esterilização dos meios de cultura 
Esterilização utilizando autoclave 
Completar o nível de água da autoclave, introduzir o material a ser esterilizado devidamente 
embalado, fechar o equipamento e iniciar o aquecimento. Abrir a válvula de equalização para remoção de 
ar, o que se garante deixando o vapor sair continuamente por 5 minutos. Abrir a válvula de equalização, 
verificar no manômetro a elevação da pressão da autoclave. Contar o tempo de 20 minutos após atingir 
15 lb/pol2 . Terminado o tempo, desligar a autoclave e deixar esfriar para poder abri-la. 
 5 
Figura 1. Esquema de funcionamento de uma autoclave, utilizada para esterilizaçãocalor úmido. 
 
Esterilização por filtração 
Esta esterilização consiste em removeras formas vivas de um fluido por passá-lo através de 
um filtro que as retenha. Em verdade, nem todas as formas vivas são eliminadas, os vírus passam através 
dos filtros bacterianos. Como não turvam o meio, nem se reproduzem na ausência de células vivas que 
possam parasitar. Os filtrados são considerados esterilizados. Este processo é indicado na esterilização de 
soluções protéicas que coagulam pelo calor, na esterilização de soluções de enzimas e toxinas que se 
inativam biologicamente pelo calor. 
 
Figura 2. Aparato utilizado para esterilização de soluções por filtração (adaptado de Seeley Jr. & Van 
den Mark, 1981). 
 
 
5. RESULTADOS 
Responda efetuando um fluxograma, iniciando com o preparo do meio, incluindo a esterilização e 
terminando com a distribuição do ágar em placas e tubos, após sua saída da autoclave. Mencione 
detalhadamente todos os cuidados para que o seu material não se contamine. 
Válvula de 
exaustão 
de vapor
Manômetro
Válvula de
saída de ar
Saída de ar
Entrada de Vapor
Saída de vapor
sob pressão
VaporVapor
ArAr
Câmara
Jaqueta
Garra
Algodão
Vácuo
Frasco Estéril
Seringa
Filtro
Tubo Estéril
 6 
PRÁTICA 1 
PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 
QUESTÕES DA AULA 
 
Nome: 
Turma: 
 
1. Sugira as funções dos componentes dos meios de cultura, que você preparou nesta prática. 
 
2. Defina “meio mínimo”, “meio de enriquecimento”, “meio seletivo” e “meio diferencial” e indique 
uma situação onde se utiliza cada um desses meios. 
 
3. Por que, algumas vezes, a esterilização de meios de cultura por calor com vapor sob pressão, 
autoclave, não é adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos? 
 
4. Após preparar meio de cultura sólido e autoclavar, o que se deve fazer? 
 7 
 
AULA 2 UBIQUIDADE _____/_____/_____ 
 
1. INTRODUÇÃO 
Os microrganismos existem onde quer que condições físicas o permitam, com distribuição 
ampla, inclusive em condições ambientais extremas colonizando os ambientes mais inóspitos do planeta. 
Em seus habitats naturais, suas vidas são influenciadas por interações com as condições físicas e 
químicas do ambiente e com outras populações de microrganismos. O ar, o solo, a água todos estes 
ambientes não estão livres de microrganismos, a não ser que estejam devidamente esterilizados. 
O meio aquático foi o ambiente original dos microrganismos, onde se diversificaram e de 
onde partiram para colonizar o ambiente terrestre. Os microrganismos estão presentes em partículas de 
poeira e, portanto, são passiveis de entrar no nosso corpo cada vez que respiramos, sendo depositados 
nos cabelos, nas roupas, pele e mucosas, e também contaminam alimentos e bebidas. Felizmente, na sua 
maioria são inócuos ou benéficos, havendo relativamente poucos que causam prejuízos ao homem. O 
microbiologista estuda o desenvolvimento dos microrganismos e tenta desvendar os processos biológicos 
da fisiologia e metabolismo de interesse. 
Quando uma célula de bactéria se multiplica em um meio sólido, a gerações de células 
resultantes usualmente permanecem juntas, formando uma massa celular que recebe o nome de colônia. 
A forma, estrutura e textura da colônia é um critério usado para distinguir uma bactéria de outra. Embora 
a morfologia da colônia seja uma característica suficientemente estável para ser usada na classificação 
bacteriana, muitas vezes podem aparecer variações espontâneas. 
1. Forma: circular, irregular, rizóide; 
 
circular irregular rizóide 
2. Tamanho: puntiforme ( menor que 1mm) ou anotar o diâmetro (mm); 
3. Cromogênese (cor); 
4. Opacidade/transparência: transparente, translúcida, opaca, brilhante; 
5. Elevação: plana, elevada, convexa, umbilicada; 
 
 plana elevada convexa umbilicada 
 
6. Superfície: lisa, rugosa, papilada; 
7. Borda: inteira (perfeita), ondulada, lobada, denteada, rizóide (filamentosa). 
 
 perfeita ondulada lobada denteada rizóide 
 
 
 
 
 8 
 
Em meios de cultivo líquidos, alguns dos tipos de crescimento observados são: 
 
 
 
 
 
Sem crescimento Turvo Floculado Película Anel Sedimento 
Obs.: Várias característica podem ser encontradas em um mesmo tubo. 
 
2. OBJETIVOS 
• Reconhecer que os microrganismos estão presentes em vários ambientes e que meios de cultura 
são necessários para o estudo de microrganismos em laboratório. 
 
 
3. MATERIAIS 
 Meios e soluções: ágar nutriente, meio ágar Sabouraud. 
 Utensílios: placas de Petri, tubos de ensaio, bico de Bunsen, alça de repicagem, "swab". 
 
 
4. PROCEDIMENTOS 
1- As placas deverão ser abertas em diferentes locais (ar, água, solo, pele, cabelo, boca, etc.) à escolha 
do aluno. 
2- As placas serão incubadas em estufa de 30º a 37ºC durante 24 horas. 
3- Reservar uma placa de Petri fechada como controle. 
4- Abrir uma placa de petri com o meio de cultura por 60 segundos próximo à chama. 
 
 
5. RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
ensaio bico de Bunsen controle 
 
 
 
 9 
1. Descreva e esquematize as características de 3 colônias de bactérias ou leveduras que você encontrou e 
anote na tabela 
Característica Colônia 1 Colônia 2 Colônia 3 
Forma 
 
Tamanho 
 
Cor 
 
Opacidade/ 
transparência 
 
Elevação 
 
Superfície 
 
Borda 
 
 
2. Anote as características encontradas para os fungos filamentosos 
 10 
PRÁTICA 2 
UBIQUIDADE 
QUESTÕES DA AULA 
 
Nome: 
Turma: 
 
1. Qual é a utilidade do bico de Bunsen no laboratório de microbiologia? 
 
 
 
 
 
 
 
2. Verifique os resultados obtidos nas placas de Petri e observe as colônias microbianas obtidas. 
Relacione o tipo de colônia com o ambiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. O que ocorreu com os controles? Justifique os resultados e tire suas conclusões sobre essa aula. 
 
 
 11 
 
AULA 3 
PLAQUEAMENTO, REPIQUE E OBTENÇÃO DE 
CULTURA PURA 
_____/_____/_____ 
 
1.- INTRODUÇÃO 
Se formos examinar um animal ou planta, uma amostra de solo, água ou alimento, ou alguma 
parte do ambiente, encontraremos diversos tipos de microrganismos. Raramente estará presente uma 
única espécie. Entretanto, é possível de isolar e multiplicar microrganismos individualmente para estudá-
los, podendo assim determinar o comportamento que cada um deles apresenta. 
Microrganismos com diferentes características genéticas, freqüentemente, possuem tipos de 
colônias também diferentes. Estas colônias podem variar em tamanho, o que pode ser medido com uma 
simples régua métrica, coloração, formato, textura e superfície. Essas características visuais permitem 
separar as colônias correspondentes a uma única espécie de microrganismo, de maneira simples, para 
melhor estudá-lo. 
Uma cultura pura consiste em um conjunto de células idênticas, correspondentes à mesma 
espécie crescidas em um meio nutritivo adequado. O isolamento de microrganismos consiste em separar 
uma espécie microbiana de outra, a partir de uma amostra com população mista. 
 
Técnicas para isolamento de culturas puras 
O isolamento de microrganismos consiste em separar uma espécie microbiana de outra a 
partir de uma amostra com população mista. Uma porção representativa da amostra é transferida com 
assepsia, para meio de cultura sólido (ágar) e em placas de Petri. Células microbianas contidas na 
amostra suficientemente separadas, são imobilizadas no gel de ágar contendo nutrientes e se multiplicam 
formando um agregado de células idênticas denominada colônia. Esse método assume que uma colônia é 
proveniente de uma única célula microbiana. Quando uma colônia isolada é transferida para um novo 
meio, as células se multiplicam livre de outros microrganismos, constituindo uma cultura pura 
A grande maioria das pesquisas no laboratório de microbiologia é realizada a partir de 
culturas puras, istoé, populações microbianas provenientes de uma única célula. Cabe ao microbiologista 
usar técnicas adequadas a fim de isolar um determinado microrganismo em cultura pura a partir de 
materiais que contém uma composição diversa de microrganismos, como por exemplo: alimentos, água, 
espécimens biológicos, etc. Dentre as técnicas empregadas para este propósito, encontramos: 
 
 Simples 
* Esgotamento – estrias Composta 
* "Pour plate" 
* Semeadura em superfície (Spread - Plate) utilizando a alça de Drigalski 
Os membros individuais das colônias ficam sujeitos a uma variedade de condições 
ambientais, conforme sua localização dentro da colônia. O crescimento desta é afetado, não só pelas 
interações celulares dentro de cada colônia, mas também por interações entre colônias vizinhas. Se as 
colônias estiverem muito próximas, elas interferem com o crescimento uma das outras pela depleção 
(esgotamento de nutrientes) no meio, ou pela excreção de produtos residuais tóxicos. O fenômeno é 
regularmente observado em “placas semeadas por estrias” utilizadas para o isolamento de bactérias. Em 
tais placas, as colônias que estão muito juntas são pequenas, enquanto as que estão bem isoladas atingem 
tamanhos maiores. 
Após a obtenção das culturas puras, faz-se necessário em alguns casos, o seu estoque em 
laboratório, para estudos posteriores. É essencial que o método de conservação e manutenção preserve 
todas as características da espécie, tais como foram evidenciadas no momento do seu isolamento. No 
laboratório, dispõem-se das seguintes técnicas para a estocagem de culturas puras: (1) transferência 
periódica para meios de culturas novos; (2) conservação das culturas sob camada de óleo mineral; (3) 
conservação das culturas pela dessecação rápida em estado de congelamento (liofilização); (4) estocagem 
em temperaturas muito baixas como por exemplo em nitrogênio líquido a – 196ºC. 
 12 
Existem organizações oficiais, cuja função é manter em estoque culturas puras autênticas de 
amostra tipos (padrões internacionais) de bactérias, fungos, algas e protozoários, assim como também, de 
células animais. Como exemplos destas instituições podemos citar: (1) American Type Culture 
Collection (ATCC). Em Rockville – Maryland; (2) Instituto Pasteur de Paris; (3) National Collection of 
Type Culture (NCTC) em Londres; (4) Japanese Type Culture Collection em Nagao Tóquio e etc. Estas 
culturas puras de amostra padrões são solicitadas a essas Instituições, sendo utilizadas em trabalhos de 
pesquisa, de controle de qualidade da rotina microbiológica, etc. Usualmente estas amostras são 
remetidas liofilizadas dentro de ampolas mediante a compra e/ou doação. 
 
Avaliação macroscópica do crescimento bacteriano: 
A. Crescimento em meios sólidos: 
Esgotamento por estrias descontínuas ou compostas 
Crescimento em ágar inclinado 
 
 
 
B. Crescimento em meios líquidos: 
Forte – Acentuada turvação com formação de depósitos e/ou película superficial. 
Escasso – Leve turvação. 
Muito escasso – turvação quase imperceptível. 
 
2 - OBJETIVOS 
• Demonstrar os métodos mais comuns para obtenção de culturas puras. 
• Executar as principais rotinas de plaqueamento e repique, tais como estrias em placas e tubos. 
 
3 - MATERIAIS 
Placas com ágar nutriente (AN), tubo com caldo nutriente, tubo com AN inclinado, tubos 
com cultura da bactéria, alça de platina, alça de Drigalski, álcool. 
 
4 - PROCEDIMENTOS 
4.1 - Semeadura por estrias em placa 
1. Flambar a alça de platina no bico de Bunsen. 
2. Esfriar rapidamente e introduzir a alça no tubo contendo o microrganismo (inóculo) 
3. Introduzir a alça na placa de Petri e deslizar a mesma em vários sentidos para obter uma 
semeadura perfeita. Fazer estria simples e composta (Fig 1 e Fig 2). 
 13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Após fazer as estrias, esterilizar a alça de repicagem; 
5. Incube as placas em posição invertida, a 37ºC por 24 horas. Observe o crescimento de 
colônias isoladas. 
 
4.2 - Semeadura por espalhamento em superfície 
1. Com o auxílio de uma pipeta esterilizada, retirar 0,1 ml da cultura do microrganismo e 
colocar em uma placa de Petri. 
2. Espalhar sobre a superfície do meio com a alça de Drigalski. 
3. Incubar a placa invertida a 37ºC por 24 horas. 
 
4.3 - Semeadura em meio líquido 
1. Com a alça de platina, retirar um inóculo do microrganismo contido no tubo de ensaio. 
2. Introduzir a alça de platina no interior do tubo. Agitar levemente e tampar novamente o 
tubo. 
3. Flambar a alça de platina. 
4. Incubar o tubo a 37ºC por 24 horas. 
 
4.4 - Semeadura em profundidade em tubo 
1. Com o fio de platina flambado no bico de Bunsen, coletar pequeno inóculo da bactéria e 
introduzir até a base do tubo de ensaio. 
2. Incubar o tubo a 37ºC por 24 horas. 
 
4.5 - Semeadura por estrias em tubo 
1. Com a alça de platina, contendo inóculo do microrganismo, fazer estrias na superfície 
inclinada do meio. 
2. Incubar o tubo a 37ºC por 24 horas. 
Figura 1 
Estria Simples: Com a alça de repicagem com material (microrganismo) 
na ponta espalhe o inóculo na parte superior da placa, como se estivesse 
limpando a alça de repicagem, esgotando o inóculo, em movimento de 
zig-zag bem próximos, deslizando a alça de repicagem levemente sobre o 
ágar, com cuidado para não perfurá-lo. Continue com o movimento de 
zig-zag aproveitando toda superfície da placa. 
 
Figura 2 
Estria Composta: Divida a placa em quatro quadrantes. Espalhe o 
inóculo no 1o quadrante esgotando com a alça de repicagem, fazendo 
movimentos de zig-zag. Flambe novamente a alça e resfrie encostando a 
alça de repicagem na superfície do ágar. Gire a placa 90 graus e toque a 
alça no canto da estria do primeiro quadrante e deslize várias vezes, 
repetindo o movimento de zig-zag até o outro extremo do segundo 
quadrante da placa, e assim sucessivamente até o quarto quadrante. 
 14 
5 - RESULTADOS 
 1 - Esquematize o crescimento dos microrganismos obtido nas placas de Petri e nos tubos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Semeadura em tubos: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2 – Indique uma colônia que você selecionaria para isolamento. 
 15 
PRÁTICA 3 
PLAQUEAMENTO, REPIQUE E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA 
QUESTÕES DA AULA 
 
Nome: 
Turma: 
 
1. Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos microrganismos? 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Se você não obteve uma colônia isolada, sugira as possíveis razões para essa falha, e o que faria 
para tentar corrigi-la. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 16 
AULA 4 
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS PARA A DETERMINAÇÃO 
DO TIPO DE ESTRUTURA MICROBIANA 
___/___/___ 
 
 
1 - INTRODUÇÃO 
As células microbianas individuais, devido às suas dimensões, só são visíveis ao microscópio. 
Entretanto, por serem claras ou possuírem pigmentos que não são facilmente observados ao microscópio 
de campo claro, há necessidade de utilizarmos métodos de coloração para que seja possível o estudo do 
tipo e estrutura bacteriana. Como os corantes não penetram em células vivas, há necessidade de que a 
bactéria esteja morta antes de sua aplicação. 
Para realizar observações microscópicas existem dois tipos principais de preparações de lâminas: 
1. Preparação a fresco: A visualização microscópica a fresco dos organismos é difícil, dado o 
reduzido tamanho destes e o índice de refração, que é próximo ao da água, o que os torna praticamente 
incolores, quando suspensos em meio aquoso. Apesar da dificuldade de visualização, as preparações 
microscópicas a fresco são úteis para se observar viabilidade e atividades celulares como motilidade e 
fissão binária, e também observar o tamanho e a forma natural das células microbianas. Neste método, o 
microrganismo se mantém vivo, podendo ser examinados com o auxilio de corantes vitais. Basta 
adicionar uma gota de azul de metileno na superfície da lâmina e emseguida, colocar a suspensão do 
organismo e cobri-la imediatamente com uma lamínula. A observação é feita em objetiva de até 40x. 
2. Preparações fixadas e coradas: Neste método, o organismo é morto durante a fixação, e em 
seguida corado. O corante é geralmente um sal, em que um dos íons é um cromóforo. Se o cromóforo é 
positivo, o corante é básico ou catiônico, como é o caso do azul de metileno, cristal violeta ou da fucsina. 
Se o cromóforo é negativo, o corante é ácido, como o ácido pícrico. Corantes básicos são ideais para 
corar bactérias porque os ácidos nucléicos e alguns componentes da parede celular apresentam carga 
negativa e são atraídos por cromóforos catiônicos. 
As preparações coradas são realizadas em três tempos: (1) esfregaço; (2) fixação e (3) coloração. 
 
Esfregaço: consiste em se espalhar uma gota de suspensão de microrganismos na superfície de uma 
lâmina e deixar secar espontaneamente. Com a alça de semeadura bacteriológica, flambada ao rubro e 
resfriada retirar um pouco do material a ser examinado, e depositar no centro de uma lâmina de vidro 
limpa e desengordurada. Com a mesma alça, “espalhar” até se obter um esfregaço de forma oval, bem 
delgado e uniforme; deixar secar espontaneamente ao ar. Para preparar esfregaço a partir: 
 a) Da Cultura líquida: caso a cultura a ser analisada seja líquida, basta introduzir a alça 
bacteriológica dentro do tubo (de maneira asséptica), misturar bem a suspensão e retirá-la. 
Fazer o esfregaço no centro da lâmina. Convém lembrar que a alça deve ser sempre flambada 
antes de ser introduzida no tubo e após o esfregaço; e o topo do tubo deve ser flambado após 
abrir e antes de fechar, todas as normas assépticas devem ser cumpridas regularmente!!! 
b) Da Cultura em ágar: Neste caso, deve-se colocar com a alça bacteriológica uma gota de água 
destilada estéril sobre a superfície da lâmina. Em seguida, tocar levemente com a alça estéril 
(após flambar e resfriar) em uma colônia bacteriana na superfície do Ágar. Fazer o esfregaço 
no centro da lâmina misturando com a água. 
 
Fixação: A fixação do esfregaço a lâmina pode ser feita através do calor (passando a lâmina três vezes 
rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen) ou através da adição de agentes químicos, e vai permitir 
que, através da coagulação das proteínas, haja uma firme aderência das células à superfície da lâmina. 
Esta fixação irá impedir que a preparação seja carreada pelas águas de lavagem durante o processo de 
coloração. O agente fixador ideal preserva as estruturas da célula com sua forma e posição, sem produzir 
artefatos (estruturas que não existam na célula viva). O processo de fixação pode ser feito de diversas 
maneiras: (1) pelo calor, cortando com a lâmina, a chama de um bico de Bunsen duas a três vezes, com 
movimento não muito rápido ou lento demais e com a face da lâmina contendo o material, voltada para 
cima, a fim de não ter contato direto com o fogo. (2) pelo álcool a quente, cobrir a lâmina e inflamá-lo 
imediatamente. (3) a frio, quando o material for sangue, líquor, etc. que além dos germes há interesse em 
observar os aspectos citológicos, que podem ser alterados pelo calor. Utilizar como agente fixador: álcool 
– éter (1:1), álcool metílico, bicloreto de mercúrio, etc. 
 
 17 
Coloração: a coloração pode ser simples ou combinada (composta) quando usamos uma ou mais 
soluções corantes respectivamente. Nos casos em que se deseja apenas uma noção sobre a morfologia 
dos microrganismos, recorre – se às colorações simples, nas quais utilizamos apenas um corante, que 
tinge igualmente os germes e outros elementos presentes na lâmina. Quando precisamos conhecer 
maiores detalhes com relação aos caracteres dos germes, utiliza-se às denominadas colorações compostas 
ou combinadas. Estas colorações além da morfologia, colocam em evidência certas propriedades 
tintoriais das bactérias, facilitando assim a sua identificação. Nestas colorações usam-se dois ou mais 
corantes, combinados aos mordentes e diferenciadores (descoramento seletivo). 
 
I - Fixadas e Coradas: 
 1) Coloração Simples – Utiliza um único corante (básico ou ácido). Visualização do corpo 
e arranjo das células e das estruturas (Flagelo/ cápsula/ endósporo/ núcleo, 
etc.), porém não diferencia os grupos bacterianos. 
 2) Coloração Diferenciada – Utiliza-se dois ou mais corantes (ex: coloração Gram / 
coloração Mycobacterium). Ocorre separação dos grupos bacterianos. 
 
Método de Coloração Gram (coloração diferenciada): 
 É uma das principais colorações diferenciais utilizadas para bactérias. Divide estes 
microrganismos em dois grandes grupos: bactérias Gram (+), que ao final do procedimento estão coradas 
em roxo, e as bactérias Gram (-), que se coram em vermelho (rosa). Além disso, permite ainda a 
observação da forma e arranjo das células. 
 A divisão das bactérias nestes dois grandes grupos é de enorme importância taxonômica e as 
diferenças são baseadas na estrutura e composição química da parede celular bacteriana. As bactérias 
Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácidos teicóicos, enquanto que as 
bactérias Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual se encosta uma camada 
composta por lipoproteínas, fosfolipídios, proteínas e lipopolissacarídeos (LPS) constituindo a membrana 
externa. 
 Em 1884, o médico dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes 
histológicos com violeta de genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles 
continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou 
a este procedimento um contra corante (safranina, fucsina básica) e estabeleceu, a partir daí, uma nova 
metodologia de coloração diferencial. 
 Ao longo destes anos, o mecanismo da coloração de Gram foi bastante estudado e muitas 
modificações propostas, sem contudo afetar substancialmente a idéia original. 
 Entre os vários métodos de coloração bacteriana, o método de Gram é o mais empregado na 
rotina bacterioscópica, pois permite observar a forma, o tipo de agrupamento, além de prestar 
informações a respeito do comportamento do material celular frente aos corantes básicos, com a 
vantagem de fácil execução. O comportamento destas células frente a diferentes corantes, pode fornecer 
valiosa colaboração à identificação de uma espécie bacteriana. 
 O método de coloração de Gram é um método de dupla coloração, muito usado na sistemática 
bacteriana, onde são usados dois corantes: um básico do grupo das pararosanilinas (violeta de genciana, 
cristal violeta) e um corante de fundo (fucsina diluída, safranina). São usados também um mordente 
especial – a solução de lugol – que reforça a ação do corante e um diferenciador – álcool absoluto – que 
procede o descoramento seletivo. 
Inicialmente, sabe-se que os microrganismos respondem diferentemente a este método. Há os 
que retêm o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo 
com a solução iodo – iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma 
desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade, impedindo assim, a saída 
do complexo, caracterizando os organismos Gram positivos. Aqueles que permitem a remoção do 
pigmento do corante para lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da 
parede, o que leva a um aumento da porosidade celular são os Gram negativos. A adição de um contra-
corante (fucsina) permite que as células Gram-negativas descoradas pelo álcool se corem agora de 
vermelho (rosa), enquanto as bactérias Gram-positivas permanecem com a coloração inicial roxa. 
A reação de Gram tem amplo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas 
jovens respondem melhor a deferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram positivas podem se 
apresentar com Gram variável pela perda da capacidade de retenção do corante.18 
 
2 - OBJETIVOS 
1. Preparar lâminas a fresco para observação microscópica de amostra de bactérias e leveduras, 
2. Realizar técnicas de coloração simples e diferencial de células microbianas para o exame microscópico 
3. Diferenciar bactérias de acordo com sua resposta à coloração de gram 
4. Treinar o manuseio adequado do microscópio ótico composto. 
 
3 - MATERIAIS 
Microrganismos: Leveduras do fermento do pão em suspensão aquosa, infusão de batata, amostras de 
água estagnada e culturas bacterianas diversas com 24 horas de crescimento 
Meios e soluções: Solução de azul de metileno, cristal violeta, fucsina, lugol (solução de iodo), álcool 
absoluto, água destilada, óleo de imersão 
Equipamentos e utensílios: Microscópio ótico composto, lâminas, lamínulas e pipetas Pasteur, alça de 
repicagem, bico de bunsen 
 
4 – PROCEDIMENTOS 
4.1 - Preparação a fresco (leveduras): 
1. Colocar sobre a lâmina limpa uma gota do material a examinar. Ao observar leveduras, colocar 
antes, sobre a lâmina, uma gota de azul de metileno (corante vital) e depois uma gota da 
suspensão de leveduras (para evitar a contaminação do corante com o microrganismo!). 
2. - Encostando um dos bordos da lamínula na gota, deixe-a descer suavemente para evitar a 
formação de bolhas de ar entre a lâmina e a lamínula. 
 
4.2 - Coloração simples: 
1) Limpar bem a lâmina com etanol para desengordurá-la 
2) Preparo do esfregaço: 
3) Secar a lâmina ao ar antes de proceder à fixação. NÃO SECAR NO FOGO! (isso modifica o arranjo 
das células) 
4) Fixação do esfregaço à lâmina pelo calor: passar a lâmina três vezes rapidamente sobre a chama do 
bico de Bunsen em um ângulo aproximado de 45ºC. A lâmina deve ficar ligeiramente morna, mas 
não quente o suficiente a ponto de queimar a palma da mão! O excesso de calor modifica o formato 
da célula bacteriana. 
5) Coloração 
- Cobrir o esfregaço durante 30 segundos com fucsina de ZIEHL diluída 1:10 em água destilada 
ou com cristal violeta 
- Escorrer o corante. 
- Lavar em água corrente de baixa pressão. 
- Deixar secar espontaneamente ao ar. 
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 
6) Visualização ao microscópio: Adicionar cuidadosamente uma gota de óleo de imersão sobre a 
superfície do esfregaço e visualizar em objetiva de 100 x. 
OBS: As colorações simples evidenciam apenas as características morfológicas das bactérias. 
 
4.3 - Coloração de Gram: 
1) Preparo do esfregaço 
 Seguir as etapas 1, 2, 3 e 4 do item anterior 
2) Coloração 
 1º etapa: Cobrir o esfregaço com o corante por 30 segundos. Lavar a lâmina com água corrente 
por 2 – 3 segundos. 
 2ª etapa: Cobrir o esfregaço com a solução de lugol por 60 segundos. Lavar a lâmina com água 
corrente por 2 –3 segundos. Remover o excesso de água cuidadosamente. 
 19 
 3ª etapa: Cobrir o esfregaço com bastante álcool (etanol 95%). por 15 – 25 segundos. Lavar a 
lâmina com água corrente por 2 – 3 segundos imediatamente após o tratamento com álcool. Remover o 
excesso de água cuidadosamente. 
 4ª etapa: Cobrir o esfregaço com fucsina por 20 segundos. Rinsar a lâmina com água para retirar 
o excesso de corante. Remover o excesso de água cuidadosamente com o papel toalha. 
6) Visualização ao microscópio: Adicionar cuidadosamente uma gota de óleo de imersão sobre a 
superfície do esfregaço e visualizar em objetiva de 100 x. 
 
 
PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO DE GRAM 
1 - Core o esfregaço com
cristal violeta por 1 min.
2 - Lave a coloração com
água destilada.
3 - Cubra com a solução
de Lugol por 1 min.
4 - Lave o excesso de
Lugol com água.
5 - Lave a preparação com
 etanol 95% (rapidamente)
6 - Lave o excesso de
álcool com água.
7 - Cubra o esfregaço
com solução de Fucsina
por 30 segundos.
8 - Lave o excesso de
Fucsina com água.
9 - Deixe a preparação
secar ao ar ou entre folhas
de papel de filtro.
 
Figura 01 - Procedimento para coloração de Gram (Adaptado de Cappuccino & Sheman, 1987). 
 20 
5 - RESULTADOS 
1 - Desenhe os campos observados, fazendo distinção entre as diversas amostras de microrganismos, com 
relação ao tamanho, à forma, o arranjo, cor predominante (citar o aumento do microscópio) e a 
motilidade (quando houver). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Preparação a fresco coloração simples coloração de gram 
Aumento: aumento: aumento: 
 
Microrganismo Forma Arranjo Predominante Gram 
 
 
 
 
 
 
 21 
PRÁTICA 4 
TÉCNICAS MICROSCÓPICAS PARA A DETERMINAÇÃO DO TIPO DE ESTRUTURA 
MICROBIANA 
QUESTÕES DA AULA 
 
Nome: 
Turma: 
 
1. Qual é o propósito da fixação pelo calor do esfregaço? Perfeita aderência da amostra na lamina para 
que ela não seja levada com as lavagens. 
 
2. Compare as técnicas de preparação microscópica a fresco com preparações fixadas e coradas. Cite 
vantagens e desvantagens de cada uma. 
 
 
3. Por que a coloração de Gram é importante em microbiologia? 
 
4. Qual é a importância do Lugol (iodo) na coloração de Gram? 
 
 
5. Qual é a função do álcool na técnica de coloração de Gram? 
 
 
 
 22 
 
AULA 5 
ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS EM CULTURA 
PURA 
___/___/___ 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 Os estudos microbiológicos e suas aplicações são efetuados com a população dos 
microrganismos e não com uma única célula, sendo somente válidos se realizados com culturas 
comprovadamente puras. 
 O crescimento microbiano é medido pelo aumento populacional podendo ser expresso em termos 
de número de células, massa celular ou qualquer propriedade que aumenta linearmente com a massa de 
células. Existem diversos métodos para avaliar o crescimento microbiano e a escolha de um deles 
depende da amostra e do objetivo da avaliação. O procedimento para estimar a população bacteriana pela 
contagem de colônias em placas, contagem de células viáveis, pode ser utilizando diluições seriadas e 
plaqueamento em mistura (pour plate) ou espalhamento em superfície (spread plate). O resultado é 
expresso como UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por volume da amostra. O procedimento para 
estimar a população por turbidimetria emprega-se o espectrofotômetro e se dá através da turbidez da 
cultura. Quando uma bactéria se multiplica em meio líquido este meio fica turvo ou com alta quantidade 
de células. Os procedimentos por peso seco de células ou pelas proteínas totais também são usados para 
contagem, entretanto com menor freqüência em relação aos métodos anteriores. 
 
2. OBJETIVOS 
Executar rotina de plaqueamento, visando à contagem de microrganismos em uma amostra. 
 
3. PROCEDIMENTO 
 
3.1-Diluição seriada 
Prepare diluições decimais seriadas da amostra disponível transferindo assepticamente, utilizando pipetas 
estéreis e pipetadores, 1 mL da amostra para tubo de salina com 9 mL até a diluição de 10 –6: 1:10 (10-
1) até 1:1.000000 (10-6). Identifique os tubos com as respectivas diluições; 
 
Transferir 1mLTransferir 1mL
da culturada cultura
para 9 mL depara 9 mL de
solução salinasolução salina
CulturaCultura
bacterianabacteriana
1mL1mL 1mL1mL
DiluiçãoDiluição
1:101:10
DiluiçãoDiluição
1:10001:1000
DiluiçãoDiluição
1:1001:100
etc...etc...
9 mL de9 mL de
soluçãosolução
salinasalina
1 mL1 mL
Incubação por 24 a 48 horasIncubação por 24 a 48 horas
Contagem de colôniasContagem de colônias
(25-300)(25-300)
1 mL1 mL 1 mL1 mL
 
3.2-Método de plaqueamento em superfície ou “spread plate” 
Figura 1: Esquema para 
quantificar bactéria 
 
0,1ml 0,1ml 0,1ml 
 23 
 
• Transfira uma alíquota de 0,1 ml de cada diluição para a placa de Petri contendo o meio de 
cultura (AN). Flambe a alça de Drigalski e após seu resfriamento, homogeneíze deslizando 
vagarosamente a alça sobre o meio de cultura contendo a bactéria; 
• Aguarde o meio absorver o líquido; 
• Incube na estufa a 37 oC por 24 a 48 horas; 
 
3.3-Método de plaqueamento em Porfundidade ou “Pour Plate” 
• Identifique as placas a serem utilizadas com o nome da amostra, a diluição e a data; 
• Derretao meio e mantenha-o a cerca de 45ºC até o uso; 
• Pipete 1ml de cada diluição e coloque em cerca de 15ml de meio fundido a 45ºC, usando uma 
pipeta limpa para cada diluição (deixe a placa aberta apenas o tempo necessário); 
• Despeje o meio fundido com a bactéria na placa; 
• Mova a placa delicadamente, desenhando o nº8 sobre a bancada, para homogeneizar; 
• Espere o meio solidificar, inverta as placas e leve-as para incubar por 24-48 horas. 
 
 3.4-Contagem 
Após a incubação conte o número de colônias por placa. Avalie a densidade populacional na amostra: 
 
 UFC/ml = UFC (média). FD/alíquota 
 
 Onde: 
 UFC/ml: Unidades Formadoras de Colônias por ml da amostra; 
 UFC (média): Média do Número de Colônias por placa na diluição; 
 FD: Fator de Diluição. 
 
3.5-Medida da densidade populacional em uma amostra de cultura pura por turbidimetria 
• Retire com assepsia cerca de 5ml do meio de cultura empregado no experimento e coloque na 
cubeta. Zerar o equipamento com o meio de cultura sem a bactéria inoculada; 
 
• Retirar o mesmo volume do meio de cultura com a bactéria inoculada e medir a DO desta 
primeira amostra. Esta primeira leitura será considerada o tempo zero; 
 
• Repetir o procedimento para os tempos seguintes. Quando a DO atingir cerca de 0,6, começar a 
diluir a amostra com o próprio meio de cultura. Quando necessário, fazer diluições 1:2, 1:3 e 
assim, sucessivamente. 
 
3. RESULTADOS 
Medida da densidade populacional em amostra de cultura pura - Contagem de colônias em placa: 
1. Selecione placas com 25 a 300 colônias e complete a tabela abaixo fornecendo as Unidades 
Formadoras de Colônias (UFC): 
 
DILUIÇÕES 
Amostras 1:10 1:100 1:1.000 1:10.000 1:100.000 1:1.000.000 
1 1500000/0,1
ml=1,5x108 
150000 15000 1500 150 15 
2 
3 
 
2. Calcule o número de microrganismos por volume das amostras. 
 
 24 
 
Medida da densidade populacional em uma amostra de cultura pura por turbidimetria 
1. Completar a tabela com os valores de D.O. (densidade ótica). 
 
Amostras 1 2 3 
Tempo 
T0 
T1 
T2 
T3 
T4 
T5 
T6 
T7 
 
Represente graficamente o crescimento microbiano das culturas baseando-se nos dados da tabela acima. 
 25 
PRÁTICA 5 
ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS EM CULTURA PURA 
QUESTÕES DA AULA PRÁTICA 
 
Nome: 
Turma: 
 
1. Qual é a finalidade das diluições seriadas efetuadas durante o procedimento de enumeração de 
microrganismos? 
Promover isolamento de colônias para facilitar a contagem de microrganismos em uma amostra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Por que ao realizarmos contagem em placas consideramos somente aquelas que estão entre 25 e 
300 UFC? 
Porque são números possíveis de serem contados e significativos (indicando nível de 
contaminação de alimentos, por exemplo) em relação a contagem de colônias. Além disso, 
um numero menor que 25 pode fazer com que não se obtenha colônias no final do 
plaqueamento, já um numero maior que 300 pode ocasionar a fusão de colônias e erro na 
contagem. 
 26 
 
AULA 6 
AÇÃO DE AGENTES QUÍMICOS E FÍSICOS SOBRE AS 
BACTÉRIAS 
___/___/___ 
 
1. INTRODUÇÃO 
Os agentes chamados de desinfetantes são tipicamente aplicados em objetos e os agentes anti-
sépticos são aplicados em tecidos vivos. Os mecanismos básicos de ação são desnaturação de proteínas e 
solubilização de lipídeos. Eles podem ser agrupados se afetarem as proteínas, membranas ou outros 
componentes celulares. Outros compostos celulares afetados pelos agentes químicos e físicos incluem os 
ácidos nucléicos e os sistemas produtores de energia. 
A potência ou eficácia de um agente antimicrobiano químico é influenciada pelo tempo, 
temperatura, pH e concentração. Assim, eles podem ser bactericidas ou bacteriostáticos. O método do 
papel de filtro e o método da diluição permitem avaliar a eficácia dos agentes químicos. 
Os surfactantes são compostos solúveis que reduzem a tensão superficial, da mesma maneira que 
os sabões e detergentes quebram as partículas de gordura. Os surfactantes incluem os álcoois, detergentes 
e os compostos quartenários de amônio. 
 
Sabões e detergentes: 
Os sabões têm pouco valor anti-séptico, mas possui uma função importante na remoção mecânica dos 
micróbios através da esfregação. 
Estes contêm álcalis e sódio e matam muitas espécies de Streptococcus, Micrococcus e Neisseria. Os 
detergentes são ditos catiônicos se eles são carregados positivamente, sendo muito empregados para 
sanitizar utensílios usados na alimentação. Os aniônicos se são carregados negativamente, sendo muito 
utilizados para lavagem de roupas e como agentes de limpeza doméstica. São menos efetivos que os 
catiônicos provavelmente porque são repelidos pelas cargas negativas da parede celular bacteriana. Os 
detergentes iônicos, especialmente os quaternários de amônio, possuem a capacidade de limpeza 
relacionada à parte positivamente carregada. 
 
Ácidos e álcalis: 
Sabão é uma base moderada. Ácidos fracos, inibem a fermentação e assim impedem a produção de 
energia em certas bactérias e fungos. Vários são usados como conservantes de alimentos. Ácido 
propiônico e láctico retardam o crescimento fúngico em Paes e outros produtos. O ácido benzóico e 
vários de seus derivados são usados para impedir o crescimento de fungos em refrigerantes, ketchup e 
margarina. Ácido sórbico e os sorbatos são usados para impedir o crescimento fúngico em queijos e em 
uma variedade de outros alimentos. 
 
Metais pesados: 
Os mais empregados são o selênio, mercúrio, cobre e prata. Nitrato de prata foi usado 
amplamente para prevenir infecções por gonococos em bebes recém-nascidos. Compostos organo-
mercuriais como mercúrio-cromo e o mertiolate, são usados na superfície da pele, sendo bastante 
eficazes contra Mycobacterium. O sulfito de selênio mata fungos, incluindo esporos. Xampus que contem 
este composto são eficazes no controle da caspa, que é uma crosta e descamação do couro cabeludo 
causada geralmente por fungos. O sulfato de cobre é usado no controle do crescimento de algas. O 
cloreto de zinco é um ingrediente comum em soluções para bochecho e óxido de zinco é usado em tintas 
como antifúngico. 
 
Halogênios: 
 O ácido hipocloroso, formado pela adição de cloro `a água controla microrganismos na água 
potável e nas piscinas. É ingrediente ativo em alvejantes caseiros (hipoclorito de sódio) e usados para 
desinfetar utensílios de cozinha. O cloro é facilmente inativado pela presença de matérias orgânicas. As 
cloraminas, consistem de cloro e amônia. São efetivos em matéria orgânica, porém agem mais 
lentamente. O iodo, usado como tintura de iodo, foi um dos primeiros anti-sépticos utilizados para a pele. 
O iodóforo é uma combinação de iodo e uma molécula orgânica, da qual o iodo é liberado lentamente. 
Os preparados comerciais mais comuns são Betadine e isodine, usados para limpezas cirúrgicas no local 
onde são feitas as incisões. Um mecanismo proposto para a atividade do iodo é a capacidade dele se 
 27 
combinar com o aminoácido tirosina, um componente comum de muitas enzimas e outras proteínas 
celulares. O bromo é, às vezes, usado na forma gasosa de brometo de metil para fumigar o solo que ser[a 
usado na propagação de plantas forrageiras. 
Álcoois: 
Desnaturam proteínas e dissolvem as membranas. Álcool etílico e isopropílico podem ser usados como 
anti-sépticos para a pele. O isopropílico, mais usado, desinfeta o local onde as injeções irão ser aplicadas 
ou onde o sangue será colhido. O álcool desinfeta, mas não esteriliza a pele, porque evapora rapidamente 
e permanece em contato com os microrganismos por pouco tempo, não penetrando profundamente nos 
poros. O álcool 70% é mais efetivo que o puro porque a desnaturação requer água. Etanol e isopropanol 
são usados para aumentar a efetividade de outros agentes químicos. 
 
Fenóis: 
O fenol e seus derivados, fenólicos, rompem as membranas das células, desnaturam as proteínas e 
inativamenzimas. Sua ação não é impedida por materiais orgânicos. Uma mistura de derivados de fenol 
chamada de cresóis é encontrada no creosoto, uma substância usada para prevenir o apodrecimento de 
postes de madeira, cercas e dormentes em vias férreas. Seu uso é limitado porque é irritante para a pele e 
também um carcinogênico. 
 
Agentes oxidantes: 
Estes rompem as pontes dissulfeto nas proteínas e conseqüentemente alteram a estrutura das membranas. 
O peróxido de hidrogênio que forma reações de superóxido (O2
-), usado para limpar ferimentos e 
eliminar anaeróbios obrigatórios. Ele é usado também para desinfetar objetos inanimados. Indústrias de 
alimentos têm aumentado o emprego de peróxido de hidrogênio em empacotamento asséptico. Os 
materiais passam através de uma solução quente do produto antes de serem reunidos em um contêiner. O 
ozônio (O3) é uma forma altamente reativa. É responsável pelo odor fresco do ar após uma tempestade 
elétrica. É usado para suplementar o cloro na desinfecção da água, pois auxilia a neutralizar o gosto e o 
odor. Peróxido de benzoíla mais conhecido para tratamento da acne, causada por um tipo de bactéria 
anaeróbia. 
 
Agentes alquilantes: 
Estes quebram estrutura de proteínas e dos ácidos nucléicos, por formarem ligações cruzadas covalentes 
com vários grupos funcionais orgânicos nas proteínas (-HH2, -OH, -COOH e –SH). Podem causar câncer 
devido à capacidade de romperem os ácidos nucléicos e portanto, não deve ser usados em situações onde 
eles possam afetar as células humanas. O glutaraldeído, relacionado ao formaldeído, é usado para 
desinfetar os instrumentos hospitalares, incluindo e equipamento de terapia respiratória, mata todos os 
microrganismos, incluindo esporos. Ambos, glutaraldeído e a formalina são usados por agentes 
funerários para embalsamar. Óxido de etileno é um gás que esteriliza em uma câmara fechada, matando 
todos os micróbios e endósporos. Por ser explosivo e tóxico, é misturado a dióxido de carbono ou 
nitrogênio, que não são inflamáveis. São utilizados para esterilizar suprimentos e equipamentos médicos. 
 
Corantes: 
Certos corantes, como o cristal violeta, interferem na formação da parede celular, principalmente de 
gram-positivas. Pode ser usado para tratar protozoários(Trichomonas) e leveduras (Candida albicans). 
Azul de metileno inibe o crescimento de algumas bactérias em cultivo. 
 
Outros: 
Certos óleos vegetais possuem uso antimicrobiano especial. Timol, derivado do tomilho é usado como 
conservante, o eugenol, derivado do cravo-da-india. Outros agentes como sulfitos e dióxido de enxofre, 
para preservar frutas secas e melados, nitrito de sódio, para preservar carnes curadas e algumas cruas. 
 
 28 
 
ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO 
1.- Agentes físicos: 
 
 De feixe eletrônico – Raios Catódicos. 
 Raios Gama 
Radiações Ionizantes Rios X 
 
 Não Ionizante – Ultravioleta (15-390mm) 
 
 Vibrações Sônicas – 9000 ciclos/ segundo. 
 Acústica Vibrações Ultra- sônicas – 300.000 c/s. 
 
 Flambagem – Usado em rotina. 
 Seco Incineração – materiais a serem descartados. 
 Forno de Pasteur – 170-180ºC por 1-2 horas 
 
 62,8ºC por 30’. 
Calor Baixa Pasteurização 71,7ºC por 15s. 
 
 Água fervente Contínuo ou Fracionado 
 Úmido para 100ºC ou 
 Temperatura Vapor fluente Tindalização. 
 
 Acima Autoclave de Chamberland 
 100ºC 15-20 minutos a 121ºC. 
 
 Algodão – embuchamento dos tubos de ensaio. 
 Berkefeld – diatomáceas. 
 Velas Bacteriológicas Chamberland – porcelana. 
 
Mecânicos Discos Filtrantes Seitz – eks –asbesto. 
(filtração) Millipore – éster de celulose. 
 Membranas Filtrantes Diâmetros dos poros 0,01-10m. 
 Filtros de alta eficiência para retenção 
 Filtros Hepa de partículas de ar (fluxo laminar). 
 
 29 
2.- Agentes químicos 
 
 Fenol = Ac. Fênico = ac. Carbólico. 
Fenóis e Derivados Cresóis; Hexilresorcinol. 
 Ac. salicílico e Ac. Benzóico. 
 
 
Álcoois Metílico, Etílico, Butílico, Propílico. 
 
Halogênios Iodo – Tintura de iodo; Iodóforos (pvp). 
 Cloro – Cloraminas; Hipoclorito de sódio ou cálcio. 
 
 
 Mercúrio – Bicloreto; Mercurocromo; Mertiolato. 
 Metais Prata – Nitrato de Prata. 
Pesados Cobre – Sulfato de Cobre. 
 
 Verde: Brilhante e Malaquita. 
 Derivados trifenilmetano Violetas: Cristal e genciana. 
Corantes 
 Derivados de Acridina Acriflavina e Proflavira. 
 
Detergentes Aniônicos – Lauril Sulfato de Sódio 
Sintéticos Catiônicos – Cloreto de Cetilpiridínio. 
 
Compostos Quartenário Cloreto de Cetilpiridínio. 
 de Amônio. Cloreto de Benzalcônio. 
 
Oxidantes Água oxigenada; Permanganato de Potássio. 
 
Ácidos e Álcalis Ac. Sulfúrico; Ac. Clorídrico, Soda. 
 
Glutaraldeído 
 
 Óxido de etileno. 
Esterelizantes Beta – Propiolactona. 
 Gasosos Formaldeído. 
 
 30 
Desinfetante: É um agente normalmente químico, que mata as formas vegetativas, mas não, 
necessariamente, as formas esporuladas de micróbios patogênicos. O termo é comumente utilizado para 
as substâncias aplicadas em objetos inanimados. 
Desinfecção: é o processo de destruição dos agentes infecciosos ou patogênicos. 
Anti – séptico: É uma substância que previne o crescimento ou ação de microrganismo, pela 
destruição dos mesmos ou pela inibição do seu crescimento ou atividade. Usualmente está associado com 
substâncias aplicadas ao corpo do homem, isto é, os tecidos vivos, por exemplo: anti–sepsia da pele e 
feridas. 
Degermação: É a redução do número de bactérias da pele pelo uso de sabão e escovagem ou 
aplicação de sabão ou solução contendo anti – séptico. 
Saneador: É um agente que reduz a população microbiana até níveis consideráveis, de acordo 
com as exigências da Saúde Pública. Normalmente é um agente químico que mata 99,9% das bactérias 
vegetativas. Os saneadores são comumente aplicados a objetos inanimados e são, geralmente, 
empregados no tratamento diário de equipamentos e utensílios de leiterias, assim como de copos, pratos e 
talheres, em restaurantes. O processo de desinfecção poderia levar ao saneamento, entretanto, em sentido 
restrito, o saneamento implica uma condição sanitária, o que não ocorre necessariamente com a 
desinfecção. 
Germicida (Microbicida): É um agente que mata as formas vegetativas, mas não 
necessariamente, as formas esporuladas dos germes. Na prática, um germicida é quase a mesma coisa 
que um desinfetante, embora o termo germicida, seja ordinariamente usadopara todos os tipos de germes 
(ou micróbios) e para qualquer aplicação. 
Bactericida: É um agente que mata as bactérias. De modo similar os termos fungicidas, viricida e 
esporicida se referem aos agentes que matam respectivamente os fungos, vírus e esporos. 
Bacteriostase: É uma condição, na qual se previne o crescimento de bactérias (adjetivo – 
bacteriostático). De maneira semelhante, fungistático descreve o agente que inibe o desenvolvimento dos 
fungos. Aqueles agentes que têm em comum a capacidade de inibir o crescimento de microrganismos são 
designados como agentes microbiostáticos. 
Agente antimicrobiano: É aquele que interfere com o crescimento, ou atividade dos micróbios. 
Na linguagem comum, o termo significa inibição do crescimento e, de acordo com o tipo de germes 
sobre os quais agem, recebem a designação de antibacteriano ou antifúngicos. Alguns agentes 
antimicrobianos são usados no tratamento de infecções, então são chamados de agentes terapêuticos. 
 
2. OBJETIVOS 
Verificar diversas substâncias químicas e físicas que inibem ou eliminam microrganismos 
 
3. MATERIAL 
Reagentes: Álcool a 70%, H2O2 a 3%, lugol, hipoclorito de sódio 2%, luz ultra-violeta, 
Cultura: E. coli, Staphylococcus aureus e uma levedura. 
Outros: zaragatoa ou “swab”, discos de papel embebidos nos reagentes acima citados, pinça 
 
4. PROCEDIMENTO 
1. Mergulhar o “swab” nas culturas e escorrer o excesso na parede do tubo. 
2. Passar o “swab” delicadamente por toda a superfície do meio de cultura. Fazer em duplicata. Em 
seguida, identificar as placas com o nome da cultura e o nome do aluno. 
3. Com a pinça flambada adicionar em três placas, um com E. coli, uma com Staphylococcus 
aureus e outra com a levedura, os papéis de filtro embebidos com as soluções. Dar um espaço 
entre eles. 
4. As outras três placas restantes expor à radiação ultra-violeta por 5 minutos. Deixar a tampa das 
placas meio abertas de forma que somente uma metade da placa entre em contato com a luz U.V. 
5. Fazer uma placa para controle 
6. Incubar a 37C por 48horas. Fazer a leitura dos halos formados com uma régua e anotar o 
resultado na tabela. 
 
 
 
 31 
5. RESULTADOS 
 
TESTE Microrganismo resultado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mostrar a substância mais eficiente para eliminar cada cultura. 
 32 
PRÁTICA 6 
AÇÃO DE AGENTES QUÍMICOS E FÍSICOS SOBRE AS BACTÉRIAS 
QUESTÕES DA AULA PRÁTICA 
 
 
Nome: 
 
Turma: 
 
 
1. Qual a diferença de esterilizar e desinfetar? 
 
 
 
 
2. Que fatores afetam a potência dos agentes antimicrobianos químicos? 
 
 
 
 
 
3. Como se poderia avaliar a eficácia de agente antimicrobiano químico? 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Enumerar alguns tipos de agentes químicos usados como desinfetante e como anti-séptico. 
Desinfetante: água sanitária, álcool 70%. 
Anti-séptico: água oxigenada, iodo, mercúrio, sabonetes
 33 
 
AULA 7 
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ATRAVÉS DE TESTES 
BIOQUÍMICOS 
___/___/___ 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Após o isolamento em cultura pura os microrganismos podem ser identificados no laboratório. 
Milhares de espécies bacterianas já foram isoladas e suas características descritas no Manual de Bergey, 
uma referência em qualquer estudo de bacteriologia. 
 A identificação de bactérias é realizada, observando as características: morfológicas, como 
dimensão, forma, arranjo e estrutura das células; culturais, como aparência macroscópica em diferentes 
meios de cultura; fisiológicas, como capacidade dos microrganismos em sintetizar enzimas intra ou 
extracelulares, assimilar diferentes substratos ou gerar produtos metabólicos específicos e genéticas, 
identificando regiões específicas do genoma da célula. 
 O metabolismo celular compreende transformações dos nutrientes por reações químicas 
organizadas, catalisadas por enzimas. As enzimas são a expressão do potencial genético da célula, e são, 
portanto, responsáveis pela sua identidade. Quanto ao local da atividade catalítica, as enzimas podem ser 
classificadas como intracelulares ou extracelulares. Enzimas extracelulares ou ligadas a parede 
exercem sua atividade catalítica fora da célula, algumas transformam substratos de elevado peso 
molecular em compostos menores para serem transportados através da membrana e metabolizados no 
interior da célula. Enzimas intracelulares são responsáveis pela síntese das estruturas celulares e 
produção de energia. 
 O metabolismo gera produtos que são excretados pela bactéria no meio de cultura e a presença 
ou ausência desses produtos, pode ser utilizada na sua identificação. 
 Nesta prática algumas provas bioquímicas utilizadas na identificação de bactérias serão 
demonstradas, como, presença da enzima extracelular amilase, responsável pela hidrólise do amido, e de 
algumas enzimas intracelulares, como triptofanase. Algumas provas bioquímicas importantes na 
identificação de bactérias são descritas a seguir: 
 
1. TESTE IMVC 
São assim denominados os seguintes testes bioquímicos: Indol, Vermelho de Metila, Vosges-
Proskauer “i” Citrato, importantes para diferenciar as bactérias entéricas (intestinais) de natureza 
patogênica ou não, que podem estar presentes como contaminantes da água e dos alimentos. 
 
 1.1. Produção de Indol 
A ação de algumas bactérias sobre o aminoácido triptofano presente em peptonas, gera um 
produto volátil denominado indol. A enzima responsável por essa transformação é a triptofanase. A 
presença do indol pode ser detectada pela adição do reativo de Kovacs (3 a 4 gotas) após crescimento 
da cultura, resultando na formação de uma coloração vermelha na superfície do líquido (resultado 
positivo) . A ausência da coloração vermelha indica que o triptofano não foi hidrolisado (resultado 
negativo). 
triptofano triptofanase indol + ác. pirúvico + NH3 
Meio sim - dissolver 30g em 1 litro de água destilada, distribuir em tubos de 4 cm e 
esterilizar em autoclave. 
 
 1.2. Vermelho de Metila 
Algumas bactérias fermentam a glicose com produção dos ácidos fórmico, acético, lático, 
succínico e outros produtos. Esses ácidos promovem uma diminuição nos valores de pH do meio. 
Essas diferenças metabólicas podem ser evidenciadas pela adição de uma solução de vermelho de 
metila (indicador de pH) ao meio onde foi cultivado o microrganismo de interesse (10 gotas).. Em 
meios acidificados (pH < 4,2) o indicador torna-se vermelho (resultado positivo), acima de pH  4,2 o 
indicador adquire cor amarela (resultado negativo). 
 
 34 
 1.3. Voges-Proskauer 
Algumas bactérias fermentam a glicose com produção de ácido acético que posteriormente se 
transforma em produtos neutros como acetil-metil-carbinol (acetoína). A detecção da acetoína 
constitui a base da reação VP. Em presença de oxigênio, acetil-metil-carbinol forma diacetil que ao 
reagir com KOH forma um complexo de cor róseo-avermelhada. Após crescimento da bactéria 
adiciona-se a cada tubo com 2 mL de meio, 45 gotas do reagente I de Barrit (solução de -naftol 5%) 
e 15 gotas do regente II (solução de KOH 40%), deixando em repouso por 15 min. Na presença dos 
reagentes a acetoína é oxidada a diacetil levando ao aparecimento de uma coloração rósea-
avermelhada (resultado positivo). 
 
glicose ácidos acetoína -naftol+KOH diacetil + guanidina (róseo) 
 
 
 1.4. Utilização do Citrato 
 A utilização do citrato como única fonte de carbono indica a presença de citrato permease, 
que transporta o citrato para o interior da célula. Do metabolismo do citrato é produzido piruvato e 
CO2. Este último, ao reagir com o sódio presente no meio, forma o carbonato de sódio elevando o pH. 
O meio Ágar Citrato de Simmons( pH 7,3 – verde) possui citrato de sódio como única fonte de 
carbono e azul de bromotimol como indicador de pH. Com o aumento do pH o meio adquire uma cor 
azul (pH 7,6), indicando resultado positivo para o teste de utilização do citrato. 
 
citrato (extracel.) citratopermease citrato (intracel.) citrase ác. cítrico ác. pirúvico + CO2 
 (adicionando Na+ no meio) forma carbonato de Na+ elevando o pH do meio 
Agar citrato simmons – dissolver 22,50g em 1000 ml de agua destilada e autoclavar. 
 
2. HIDRÓLISE DO AMIDO 
Bactérias que utilizam o amido como fonte de carbono produzem amilase, enzima 
extracelular, capaz de hidrolisar o amido. A ação desta enzima pode ser facilmente evidenciada 
estriando a bactéria a ser testada em meio sólido contendo amido (0,2%) e adicionando após o 
crescimento, solução saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura. O iodo reage com amido 
formando um complexo de cor azul. O aparecimento de zonas claras ao redor das colônias de 
bactérias indica o desaparecimento das cadeias de amido pela secreção da enzima, resultado positivo 
para amilase. 
 
amido amilase dextrinas maltose (gli + gli) maltase glicose 
 
3. CATALASE 
 Organismos capazes de produzir catalase ou peroxidase rapidamente degradam peróxido de 
hidrogênio que é produzido durante a respiração aeróbica. A produção de catalase pode ser detectada 
quando ao se adicionar à cultura crescida, H2O2, haverá formação de bolhas, indicativo da presença de 
O2 livre. 
 
2H2O2 catalase 2H2O + O2 
 
4. URÉIA 
 Este teste serve para distinguir rapidamente membros do gênero de outros microrganismos 
entéricos não fermentadores de lactose, como Proteus.Urease é uma enzima que cliva a uréia produzindo 
amônia. A presença de amônia deixa o meio alcalino fazendo o indicador vermelho de fenol presente no 
meio, mudar de vermelho para rosa. 
 
Uréia + 2H2O urease CO2 + H2O + 2 NH3 
 
5. MOBILIDADE E SUFETO DE HIDROGÊNIO 
 H2S - Existem duas vias fermentativas pelas quais alguns microrganismos são capazes de 
produzir sulfeto de hidrogênio (H2S). Via 1:pela redução de compostos orgânicos com enxofre em 
aminoácidos cisteína presente na peptona do meio de cultura. Este aminoácido na presença de cisteína 
desulfurase perde o átomo enxofre que é então reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar o 
 35 
gás H2S. Via 2: pela redução de compostos orgânicos com enxofre, tais como tiosulfatos (S2O3
=), 
sulfatos (SO4
=) ou sulfitos (SO3
=). O meio contém tiosulfato que certos microrganismos são capazes de 
reduzir a sulfito com liberação de sulfeto de hidrogênio. Este gás é detectado devido à presença de 
sulfato de amônio ferroso no meio que quando reage com o gás forma um precipitado sulfeto ferroso 
preto no local da inoculação da cultura. 
 Mobilidade – é reconhecida quando a cultura cresce também fora da linha de inoculação. 
 
Cisteína cisteína desulfurase Ác. pirúvico + H2S + NH3 
 
3S2O3 + 4 e
- tiosulfato redutase 2SO3
= + H2S 
(tiosulfatos) 
 
Sulfato de amônio ferroso [Fe (NH4)2 SO4] + H2S (meio preto) 
 
6. TESTE TSI (ÁGAR DE TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO) 
 Diferencia gêneros de Enterobacteriaceae de outros bacilos gram-negativos intestinais que não 
sejam enterobactérias através do padrão da fermentação de carboidratos e produção de sulfeto de 
hidrogênio. O meio contempla lactose e sacarose em concentrações de 1% e glicose em concentração de 
0,1%, o que permite detectar a utilização de apenas este carboidrato. O indicador vermelho de fenol 
muda a cor do meio de vermelho-alaranjado para amarelo em presença de ácidos. A incubação se dá de 
18 a 24 h. O meio também contém substrato para a detecção de sulfeto de hidrogênio (H2S). 
 
2. PROCEDIMENTO 
1. Cada turma prática receberá os conjuntos de provas, que deverão ser inoculados com as bactérias 
disponíveis. Os conjuntos inoculados serão incubados em estufa a 37oC por 24 a 48 h. 
 
2. Após o crescimento no respectivo meio de cultura, adicionar os reagentes para a verificação dos 
resultados. Anotar os resultados em tabela e comparar com os dados da literatura, compilados em tabela 
apropriada. Identificar as diferentes culturas utilizadas. 
 
3. RESULTADOS 
1. Preencha a tabela de resultados e compare com tabela fornecida pelo professor. 
2. Identifique as espécies testadas. 
 
Testes Bioquímicos Para Identificação de Bactérias: 
Provas Bioquímicas Cultura 1 Cultura 2 Cultura 3 Cultura 4 Cultura 5 Cultura 6 
Amido 
catalase 
urease 
Indol 
VM 
VP 
Citrato 
mobilidade 
H2S 
TSI 
 
Características morfológicas e tintoriais: 
 
Características Cultura 1 Cultura 2 Cultura 3 Cultura 4 Cultura 5 Observações 
Forma/ Arranjo 
Coloração de Gram 
 
Diagnóstico: 
Cultura 1: ................................................................................................................... 
Cultura 2: ................................................................................................................... 
 36 
Cultura 3: ................................................................................................................... 
Cultura 4: ................................................................................................................... 
 37 
PRÁTICA 7 
IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ATRAVÉS DE TESTES BIOQUÍMICOS 
QUESTÕES DA AULA PRÁTICA 
 
Nome: 
 
Turma: 
 
 
 
1) Na identificação dos microrganismos, porque os testes bioquímicos são importantes? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2) Para que o manual de Bergey é utilizado em microbiologia? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3) Na verdade, o que se confirma com estas análises bioquímicas? 
 38 
 
AULA 8 ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA ___/___/___ 
 
O reconhecimento da importância sanitária da qualidade da água e a consequente aplicação de 
medidas de tratamento têm trazido inestimáveis benefícios para a saúde do homem. A qualidade 
microbiológica da água pode ser determinada por análises bacteriológicas. Microrganismos patogênicos 
(Salmonella thyphi, Vibrio cholera, Shigella dysenteriae, vírus da hepatite, entre outros) podem ser 
isolados de águas contaminadas, usando-se procedimentos trabalhosos e demorados. É impraticável 
pesquisar, rotineiramente, todos os patógenos que possivelmente são veiculados pela água. Assim, o 
controle microbiológico da qualidade da água é feito determinando-se a presença de microrganismos de 
origem fecal cuja presença é um indicador da poluição da água por dejetos humanos e animais. 
 Dos indicadores de contaminação fecal, o que tem maior aceitação é o grupo das bactérias 
coliformes. Esse grupo é definido pelas seguintes características: bastonetes, Gram negativos, não 
formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, com capacidade de fermentar a lactose com 
produção de ácido e gás em 48 horas a 35oC. O grupo coliforme é heterogêneo, e representado pelos 
gêneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. 
 Para indicar contaminação fecal recente utilizam-se como indicadores de contaminação os 
coliformes fecais, que possuem como habitat exclusivo o intestino de animais homeotérmicos, e cujo 
representante mais importante é a Escherichia coli. Os coliformes fecais são aqueles que fermentam a 
lactose com produção de gás quando incubados a 44,5 - 45oC por 24 horas. 
 A análise de água padrão para detecção de microrganismos coliformes é dividida em três partes: 
teste presuntivo, teste confirmativo e teste completo. A observação de resultados positivos ou negativos 
obtidos em cada teste é essencial para evidenciar a presença ou ausência de contaminantes numa amostra 
de água. 
 
2. MATERIAL 
 
Meios de cultura e soluções: Tubos contendo ágar-nutriente fundido; tubos com 10 mL de caldo 
lactosado concentração dupla e normal, contendo tubos de Durhan invertidos; amostras de água de 
procedência variada. 
Equipamentos: Pipetas de 1,0 e 10 mL; frascos esterilizados para coleta das amostras de água; placas de 
Perto esterilizadas; banho-Maria a 50ºC; estufa a 37ºC; bico de bunsen, micropipetas de volume 
regulável 
 
3. PROCEDIMENTOA - Contagem do número de células viáveis em placa: 
 
1. Agitar 25 vezes a amostra; 
2. Transferir duas alíquotas de 1,0 mL para duas placas de Perto; 
3. Adicionar ágar nutriente (AN) fundido e mantido em banho-Maria a aproximadamente 50oC. Agitar 
suavemente e deixar solidificar; 
4. Incubar as placas a 37oC por 24 a 48 horas; 
5. Avaliar o número de colônias crescidas a 37oC. Anotar os resultados em tabela apropriada (item VI do 
roteiro). 
 
B - Teste presuntivo em tubos com caldo lactosado (CL): 
 
1. Identificar 3 séries de 3 tubos com as seguintes informações: turma, amostra, data, alíquota, repetição; 
2. Transferir assepticamente, 3 alíquotas de 10,0 mL(tubos com concentração dupla de caldo lactosado), 
3 alíquotas de 1,0 mL e 3 alíquotas de 0,1 mL para cada uma das 3 séries de 3 tubos contendo o caldo 
lactosado e tubos de Durhan invertidos; 
3. Incubar a 37o C por 48 horas; 
4. Avaliar a produção de gás nos tubos de Durhan, anotando o resultado em tabela; 
 39 
5. Consultar a tabela do NMP para conversão dos resultados obtidos em número presuntivo de 
coliformes/100 mL da amostra 
 
Observações: 
 O teste para detectar a presença de bactérias coliformes pode ser dividido em três partes: o 
teste presuntivo, o teste confirmativo e o teste completo. 
 No teste presuntivo se detecta microrganismos capazes de fermentar lactose com a produção de 
gás, presumivelmente coliformes. Através do emprego de inóculos múltiplos pode-se também 
determinar o número mais provável de coliformes na amostra. 
 O teste confirmativo é feito através da subcultura dos tubos lactose-positivos (produção de gás) 
em um meio seletivo-diferencial para o grupo coli-aerogenes. O teste confirmativo reduz a possibilidade 
de falsos–positivos que podem ocorrer devido a atividade metabólica de bactérias gram + formadores de 
gás. 
 As vezes é necessário isolar estas bactérias e identificá-las como coliformes através do 
procedimento do teste completo. 
 A demonstração de que isolados produtores de gás são gram-negativos, não esporulados e 
bastonetes, é evidencia conclusiva para coliformes e dispensa o teste confirmativo. 
 
3. RESULTADOS 
A - Contagem total em placa: 
 
AMOSTRA ALÍQUOTA Número de UFC 
 1,0 mL 
0,1 mL 
 1,0 mL 
0,1 mL 
 
 
B - Teste Presuntivo em Tubos: 
AMOSTRA ALÍQUOTA NÚMERO DE TUBOS (+) 
 10,0 mL 
1,0 mL 
0,1 mL 
 10,0 mL 
1,0 mL 
0,1 mL 
 
AMOSTRA 1, NMP/100 mL: __________________ 
AMOSTRA 2, NMP/100 mL: __________________ 
 
Classificação das amostras de água: ______________________ 
 40 
 
 
 41 
PRÁTICA 8 
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA 
QUESTÕES DA AULA PRÁTICA 
 
Nome: 
 
Turma: 
 
 
1. Porque utilizamos bactérias do grupo coliforme como indicadores da qualidade de água? 
2. Porque utilizamos o caldo lactosado como meio de incubação para as amostras de água durante o teste 
presuntivo? 
3. Discuta o princípio e possíveis aplicações do teste de NMP 
 42 
Tabela de determinação do Número Mais Provável (NMP) por 100 mL da amostra nos limites de 
confiança de 95%, quando são utilizados 3 tubos para cada volume de 10, 1,0 e 0,1 mL. 
 
 Número de tubos apresentando 
resultado positivo 
 Número mais 
provável 
Limite de 
confiança 95% 
 
3 tubos 
de 10 mL 
3 tubos 
de 1mL 
3 tubos 
de 0,1 mL 
 (NMP) 
por 100 mL 
Limite 
inferior 
Limite superior 
0 0 1 3 < 0,5 9 
0 1 0 3 < 0,5 13 
1 0 0 4 < 0,5 20 
1 0 1 7 1 21 
1 1 0 7 1 23 
1 1 1 11 3 36 
1 2 0 11 3 36 
2 0 0 9 1 36 
2 0 1 14 3 37 
2 1 0 15 3 44 
2 1 1 20 7 89 
2 2 0 21 4 47 
2 2 1 28 10 150 
3 0 0 23 4 120 
3 0 1 39 7 130 
3 0 2 64 15 380 
3 1 0 43 7 210 
3 1 1 75 14 230 
3 1 2 120 30 380 
3 2 0 93 15 380 
3 2 1 150 30 440 
3 2 2 210 35 470 
3 3 0 240 36 1300 
3 3 1 460 71 2400 
3 3 2 1100 150 4800 
 
CONFORME: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 14th edition. 
American Public Health Association, American Water Works Association, Water Pollution Control 
Federation, Washington, D.C., 1975 
 43 
 
AULA 9 
ISOLAMENTO E PREPARAÇÃO DE FUNGOS PARA 
OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE SUAS ESTRUTURAS 
___/___/___ 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 Os fungos são organismos heterotróficos, geralmente aeróbios e adaptados a ambientes diversos, 
onde podem existir como saprófitas, parasitas ou simbiontes. Como saprófitas, os fungos degradam a 
matéria orgânica, transformando-a em formas químicas simples que retornam ao solo. Como parasitas, 
podem causar doenças em animais e vegetais. Como simbiontes, podem existir em associação com outros 
organismos, tais como as algas, formando os líquens, ou como das raízes das plantas formando as 
micorrizas. 
Os fungos possuem dois tipos morfológicos: as leveduras, que são unicelulares, e o os bolores ou 
fungos filamentosos, que são multicelulares. 
 As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos: oval, circular etc.) e se 
reproduzem por brotamento. Outras formas de reprodução não são possíveis de se visualizar. Deve-se 
observar as características da célula vegetativa, verificando a forma, o tamanho (2 –5 a 15 0 50 um), 
presença ou ausência de cápsulas e pseudo – hifas. E, também, as características de reprodução 
vegetativa: formação, brotamento. 
 Os fungos filamentosos, ou bolores, possuem como elementos constituintes a hifa, que podem ser 
septadas ou não septadas. O conjunto de hifas é denominado micélio. Quanto à função, o micélio 
classifica-se em vegetativo e reprodutor. 
 O isolamento de fungos constitui uma etapa fundamental para a identificação e para o estudo dos 
requerimentos nutricionais e das substâncias resultantes do seu metabolismo. Os métodos utilizados para 
o isolamento e cultivo de fungos dependem muito do seu habitat natural. Geralmente empregam-se meios 
sólidos acidificados, com pH em torno de 4 a 5, com o objetivo de inibir o crescimento de bactérias. As 
exigências nutritivas dos fungos são semelhantes às das bactérias necessitam de uma fonte C e N, H2O, 
sais minerais e fatores de crescimento. Porém, quanto aos fatores ambientais, estes diferem na exigência 
à tensão de oxigênio, pois a maioria é aeróbia, sendo alguns anaeróbios facultativos. Quanto à 
temperatura, a maioria é mesófila, preferindo 25 a 30ºC e o teor de umidade tem grande importância no 
crescimento dos fungos. 
Para fungos parasitas de vegetais ou não, os métodos de isolamento variam de acordo com o 
fungo e com o tipo de lesão. Para fungos saprófitas do solo ou de alimentos, na maioria das vezes, 
coletam-se fragmentos do tecido infectado, que são posteriormente transferidos para a superfície de um 
meio de cultura apropriado. Para sua purificação, uma parte da extremidade do fungo é retirada e 
homogeneizada em uma solução de salina com tween 80%. Uma alíquota desta solução é inoculada em 
meio de cultura próprio. 
As preparações microscópicas para observação de fungos são de extrema importância, uma vez 
que a sua identificação depende, em grande parte, da observação de características morfológicas como o 
tipo de micélio e de esporos sexuados e assexuados. 
O Microcultivo de fungos realiza-se quando há necessidade de ser obter estruturas em boas 
condições para o estudo morfológico detalhado. Para executar esta técnica, é necessário ter uma placa de 
microcultivo esterilizada. Esta deve conter papel de filtro no fundo e sobre este um bastão de vidro em U, 
junto com uma lâmina e lamínula. 
 A técnica é realizada seguindo os seguintes itens: 
a) Cortar um quadrado de 5mm de ágar Saboraud e transportá-lo, com uma alça de platina, sobre 
a lâmina. 
b) Retirar pequenas porções de colônia e semear em dois lados do quadrado de ágar Saboraud. 
c) Cobrir este cultivo com uma lamínula. 
d) Umedecer o papel filtro com água destilada estéril. A placa funcionará como uma camada 
úmida. 
e) Identificar a placa