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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIFACVEST CURSO DE BIOMEDICINA HYAGO PEREIRA DE SOUSA DIAGNÓSTICO E ALTERAÇÕES LABORATORIAIS EM PACIENTES INFECTADOS PELO VÍRUS SARS-CoV-2 LAGES 2021 HYAGO PEREIRA DE SOUSA DIAGNÓSTICO E ALTERAÇÕES LABORATORIAIS EM PACIENTES INFECTADOS PELO VÍRUS SARS-CoV-2 Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Centro Universitário Unifacvest, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Jader Betsch Ruchel LAGES 2021 HYAGO PEREIRA DE SOUSA DIAGNÓSTICO E ALTERAÇÕES LABORATORIAIS EM PACIENTES INFECTADOS PELO VÍRUS SARS-CoV-2 Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Centro Universitário Unifacvest, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Jader Betsch Ruchel Lages, SC / / . Nota (Coordenador do curso de Biomedicina – Jader Betsch Ruchel) LAGES 2021 RESUMO O SARS-CoV-2 é um vírus da família Coronaviridae que apresenta RNA de fita simples positivo, circundado por uma cápsula de lipoproteína que contém uma proteína Spike ou proteína S nesta estrutura. Os sintomas mais comuns são febre, tosse e falta de ar e até insuficiência respiratória grave. O teste de diagnóstico para COVID-19 surgiu como uma ferramenta essencial para rastrear a propagação da doença durante a pandemia. Uma série de testes para diagnosticar o SARS-CoV-2 estão disponíveis. Diversas alterações laboratoriais são observadas em pacientes com COVID-19, principalmente em estágio grave e hospitalizado. O objetivo do estudo é apontar as diferentes técnicas para diagnóstico do SARS-CoV-2, avaliando seu tempo de contágio com o vírus e seus sintomas apresentados, além de demonstrar os principais parâmetros laboratoriais com alterações nos casos de COVID-19. Para isso foi realizado uma revisão bibliográfica através de artigos publicados no ano de 2019 a 2021 utilizando bases de dados como o Google Acadêmico, Science Direct, SciELO e Nature, sendo identificados e incluídos os artigos que correlacionavam com o estudo apresentado. As técnicas utilizadas foram RT- PCR, RT-LAMP, Sorológico (ELISA, Imunocromatografia e Quimiluminescência), detecção de Antigeno e Anticorpos Neutralizantes. Se destacando pela sua eficácia o RT- PCR é uma técnica considerada padrão ouro por ser de alta sensibilidade e especificidade com diagnostico a partir do 3º ao 10º dia de contágio. Testes sorológicos que detectam anticorpos IgA, IgG e IgM contra proteína do vírus são úteis da 2ª a 4ª semanas de infecção e a técnica dos Anticorpos Neutralizantes que detecta anticorpos pós-infecção e pós-vacinação. Em relação às principais alterações laboratoriais, podemos destacar leucocitose, neutrofilia e trombocitopenia devido a altos níveis de dímero-D, elevação gradual dos níveis de LDH, proteína C reativa e ferritina e há um aumento nos níveis séricos de CK, CKMB e troponina. Os testes laboratoriais são de suma importância para diagnosticar o vírus SARS-CoV-2, impedindo que pessoas infectadas transmitam para outras pessoas, bem como realizar exames periódicos com o intuito de acompanhar possíveis alterações no organismo para evitar complicações futuras. No entanto, torna-se necessário mais estudos sobre o SARS-CoV-2 e as alterações laboratoriais observadas em pessoas infectadas. Palavra-chave: COVID-19. SARS-CoV-2. Diagnóstico. Alterações Laboratoriais. ABSTRACT SARS-CoV-2 is a virus of the Coronaviridae family that presents positive single-stranded RNA, surrounded by a lipoprotein capsule that contains a Spike protein or protein S in this structure. The most common symptoms are fever, cough and shortness of breath, and even severe respiratory failure. The diagnostic test for COVID-19 has emerged as an essential tool to track the spread of the disease during the pandemic. A number of tests to diagnose SARS-CoV-2 are available. Several laboratory alterations are observed in patients with COVID-19, mainly in the severe stage and hospitalized. The aim of the study is to point out the different techniques for the diagnosis of SARS-CoV-2, evaluating its time of infection with the virus and its symptoms, in addition to demonstrating the main laboratory parameters with alterations in cases of COVID-19. For this, a bibliographic review was carried out through articles published in the year 2019 to 2021 using databases such as Google Scholar, Science Direct, SciELO and Nature, and articles that correlated with the study presented were identified and included. The techniques used were RT-PCR, RT-LAMP, Serological (ELISA, Immunochromatography and Chemiluminescence), detection of Antigen and Neutralizing Antibodies. Standing out for its effectiveness, RT-PCR is a technique considered the gold standard for being of high sensitivity and specificity with diagnosis from the 3rd to the 10th day of infection. Serological tests that detect IgA, IgG and IgM antibodies against the virus protein are useful from the 2nd to 4th weeks of infection and the Neutralizing Antibody technique that detects post-infection and post-vaccination antibodies. Regarding the main laboratory alterations, we can highlight leukocytosis, neutrophilia and thrombocytopenia due to high levels of D-dimer, gradual increase in the levels of LDH, C-reactive protein and ferritin, and there is an increase in serum levels of CK, CKMB and troponin. Laboratory tests are of paramount importance to diagnose the SARS-CoV-2 virus, preventing infected people from transmitting it to other people, as well as performing periodic exams in order to monitor possible changes in the body to avoid future complications. However, more studies are needed on SARS-CoV-2 and the laboratory changes observed in infected people. Keyword: Diagnosis. Laboratory Changes. COVID-19. SARS-CoV-2. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................5 2. OBJETIVO.................................................................................................................7 2.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................................7 2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.........................................................................................7 3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................7 4. FISIOPATOLOGIA DA COVID-19........................................................................8 5. DIAGNOSTICO LABORATORIAL PARA COVID-19......................................10 5.1 TESTE DE BIOLOGIA MOLECULAR..................................................................10 5.2 TESTE RT-LAMP....................................................................................................12 5.3 TESTE SOROLÓGICOS..........................................................................................13 5.4 TESTE AUTOMATIZADO DE ELISA...................................................................14 5.5 TESTE RÁPIDO IMUNOCROMATOGRAFICO...................................................14 5.6 TESTE DE ANTIGENO...........................................................................................16 5.7 ANTICORPOS NEUTRALIZANTES......................................................................176. DEMAIS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS......................................................19 6.1 ALTERAÇÕES DOS MARCADORES LABORATORIAIS..................................23 7. CONSIDEREÇÕES FINAIS....................................................................................27 REFERÊNCIAS.............................................................................................................28 5 1. INTRODUÇÃO O Sars-CoV-2, é o vírus causador da COVID-19, uma doença que surgiu em Wuhan (China), no final de 2019, onde teve início em um mercado de frutos do mar e animais silvestres, tomou proporções mundiais no início de 2020, levando a OMS declarar uma pandemia (LUCENA et al., 2019). O vírus mostra semelhanças com as infecções respiratórias causadas pelo vírus da SARS que foi transmitido de morcegos para outros animais como os pangolins e deste para os seres humanos por volta de 2002, sendo está uma das teorias mais aceitas, e com o MERS-CoV que foi transmitido de morcegos para camelos e deste para o homem em 2012, situação que leva a pensar que o SARS-CoV-2 possa ter características semelhantes de transmissibilidade e origem progressiva com estes vírus (NOGUEIRA et al., 2020). O coronavírus engloba uma imensa família e sabe-se que pelo menos sete desses vírus causam doenças respiratórias em humanos. De acordo com o estado de conhecimento atual, o SARS-CoV-2 é o terceiro coronavírus zoonótico que cruzou o bloqueio da espécie e infectou humanos nas últimas duas décadas. O genoma do SARS- CoV-2 está inscrito em uma única fita de RNA (ácido ribonucleico). Esse tipo de vírus sofre mutações genéticas com mais frequência do que o vírus de DNA (ácido desoxirribonucleico), pois eles têm pouca capacidade de reparar erros de transcrição. Em particular, o SARS-CoV-2 é um RNA de fita simples com a capacidade de sintetizar cerca de 29 proteínas diferentes. Certas proteínas fazem parte da superfície do vírus e facilitam sua introdução nas células hospedeiras, outras parecem estar ligadas à sua patogênese (VIEIRA et al., 2020). Os sintomas mais frequentes nos indivíduos que são contaminados pelo vírus são: febre, tosse e falta de ar, a ponto de ocorrer uma grave insuficiência respiratória, esses sintomas aparecerem de 2 a 14 dias após a exposição, podem piorar e, em alguns casos, levar a morte. O contágio pode ocorrer de diversas maneiras, como pequenas gotículas expelidas no ar pela boca e nariz, e encontradas em objetos e materiais, por isso um dos principais problemas desta pandemia é a fácil contaminação e disseminação do vírus, que pode ocorrer sem a necessidade do contato humano (LUCENA et al., 2019). Pelo fato desta pandemia ser causada por um novo coronavírus, profissionais diagnosticaram esta doença com base nos aspectos clínicos e achados laboratoriais ao contrário de métodos moleculares. Contudo, depois do isolamento do RNA viral, diversos laboratórios produziram testes de maior acurácia para o diagnóstico da SARS-CoV-2. Os 6 testes laboratoriais disponíveis para o vírus são: Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT PCR) em Tempo Real, Testes de detecção de antígeno, e Testes sorológicos, com diversas aplicações em ocasiões diferentes durante a trajetória da infecção (SINHA et al., 2020). Testes laboratoriais para diagnósticos diferenciais e acompanhamento do paciente comprovam quadros de linfopenia seguido de casos de leucocitose na maior parte dos casos, baixos índices de hemoglobina com aparecimento de microcitose e plaquetopenia, alto nível de proteína C reativa, diminuição da albumina sérica e demais globulinas circulantes, processo inflamatório acentuado promovendo alteração na VHS (velocidade de sedimentação das hemácias) e IL-6 (interleucina 6). São encontradas ainda, alterações em enzimas hepáticas como a ALT (alanina aminotransferase) e a AST (aspartato aminotransferase), e elevação do índice de LDH (lactato desidrogenase). Em determinados casos de pacientes hospitalizados em serviços de terapia intensiva é possível verificar aumento de Troponina I e Dímero-D, sendo este último intimamente ligado a aumento de IL-6, além do aumento de bilirrubinas, creatinina, PCR (proteína C- reativa) e prolactina. Em alguns casos, o paciente pode manifestar alterações em marcadores renais (ureia e creatinina), coagulação TP (tempo de protrombina), TTPa (tempo de tromboplastina parcial ativada) e glicose (ALMEIDA JUNIOR et al., 2020). Portanto o presente estudo tem como objetivo trazer as principais técnicas para diagnosticar o SARS-CoV-2, e apontar qual a melhor técnica para realizar depois do contado com o vírus, e abordar as principais alterações laboratoriais causadas pela COVID-19. 7 2. OBJETIVO 2.1 Objetivo Geral Este estudo tem como objetivo apontar as diferentes técnicas para diagnóstico do SARS-CoV-2, avaliando seu tempo de contágio com o vírus, além de demonstrar os principais parâmetros laboratoriais com alterações nos casos de COVID-19. 2.2 Objetivo Específicos 1. Apresentar a fisiopatologia da COVID-19. 2. Trazer as principais técnicas de detecção do SARS-CoV-2, presença de anticorpos e antígenos, bem como suas vantagens e desvantagens. 3. Mostrar as principais alterações laboratoriais em pessoas infectadas pelo vírus causador da COVID-19. 3. MATERIAL E MÉTODOS Para atingir os objetivos propostos realizou-se uma revisão bibliográfica com intuito de trazer as diferentes técnicas exercidas para diagnosticar o SARS-CoV-2, e apontar as principais alterações laboratoriais em pacientes infectados pelo vírus da COVD-19. Foram utilizados para o estudo artigos científicos publicados no período de 2019 a 2021. Como fundamentação para o estudo utilizou-se o método de pesquisa bibliográfica, por meio de artigos científicos, para verificar as informações, resultados e conclusões sobre o método. Os materiais de pesquisa foram coletados através de bases de dados como o Google Acadêmico, Science Direct, SciELO e Nature. Para a busca dos artigos foram utilizadas as seguintes palavras chaves: “COVID- 19”, “SARS-CoV-2”, “diagnostico”, “alterações laboratoriais”. Após a leitura dos artigos, foram selecionados os trabalhos que abordavam o assunto estudado para a pesquisa. Como critérios de exclusão foram excluídos os artigos incompletos, e que não apresentassem especificidade com o objeto de estudo através da leitura dos títulos e resumos. 8 4. FISIOPATOLOGIA DA COVID-19 Acredita-se que, a partir da década de 60, uma recombinação de coronavírus em animais ocasionou o surgimento de infecções de coronavírus em humanos (SU et al.,2016 apud CARVALHO et al., 2020). Considera-se, até ao momento, que existam sete diferentes espécies que infectam humanos, sendo elas a HCoV-229E (do gênero alphacoronavírus), descoberta em 1966, a HCoV-OC43 (do gênero betacoronavírus linhagem A), em 1967, o coronavírus de síndrome respiratória aguda grave SARS-CoV (betacoronavírus, linhagem B), o qual originou-se em um surto na China em 2002/2003, o HCoV-NL63 (alphacoronavírus), encontrado em 2004, o HCoV-HKU1 (betacoronavírus linhagem A), identificado em janeiro de 2005, a cepa do coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio, MERS-CoV (betacoronavírus, linhagem C) que provocou um surto endêmico na Península Arábica, no ano de 2012, onde se expandiu e provocou um surto no ano de 2015 na Coréia do Sul e em mais de 20 países em razão da circulação de pessoas. E o recente SARS-CoV-2 (do gênero betacoronavírus), descoberto em 31 de dezembro de 2019, na cidade de Wuhan, China através de amostras de lavagem bronco alveolar (FENG et al., 2020 apud CARVALHO et al., 2020). O SARS-CoV-2, agente etiológico da COVID-19 é uma infecção viral das vias aéreas que contagia particularmente as célulasepiteliais/alveolares e endoteliais, ocasionando a descamação de pneumócitos, presença de membrana hialina, formação e inflamação intersticial com infiltração de linfócitos. Aponta-se que alterações virais abrangem também células multinucleadas, células sinciciais e pneumócitos atípicos nos espaços intra-alveolares, que desencadeiam a SARS (MENDES et al., 2020). O SARS-CoV-2 é um vírus de RNA positivo de fita simples, e partículas globulares com aproximadamente 125nm de diâmetro, coberta por um envelope fosfolipídico. Suas partículas retratam projeções constituídas por trímeros da proteína S (spike protein), resultando na aparência de espículas, chamado também como coroa (figura 1) (USP, 2020 apud VELOZO et al., 2021). O SARS-CoV-2 conecta-se à célula do hospedeiro humano através do receptor ACE2 (enzima conversora da angiotensina 2), e seu mecanismo de entrada necessita da ação sequencial da enzima serina protease TMPRSS2. Essas informações apresentam diversos possíveis alvos terapêuticos, incluindo o eixo interleucina (IL)-6-STAT3, associado à síndrome de liberação de citocinas (CRS, do inglês cytokine release syndrome) (VIEIRA et al., 2020). 9 A transmissão do SARS-CoV-2 acontece de forma horizontal, de pessoa a pessoa, pelo contato direto ou indireto com secreções contaminadas. Estas secreções são formadas ao tossir, falar ou espirrar, práticas que criam uma nuvem gasosa contendo patógenos, composta de gotículas de diferentes tamanhos (WHO, 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). O contato indireto, por fômites, é resultado da presença do vírus em superfícies contaminadas, até mesmo pela deposição de gotículas contendo vírus e posterior toque em mucosas do nariz e boca (Harrison, Lin e Wang 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). A transmissão do vírus por indivíduos assintomáticos e pré- sintomáticos, acontece no decorrer do período de incubação, 1 a 3 dias antes do estabelecimento da sintomatologia (BAI et al., 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). A maioria dos casos acontece de forma benigna e começa com sintomas comuns de resfriado como mal-estar, coriza, febre, tosse seca, falta de ar, fadiga e mialgia. Outros sintomas também são relatados como náuseas, vômitos ou diarreia, dor de cabeça e garganta, fraqueza, confusão mental, incapacidade de sentir odores ou anosmia e perda do sentido do paladar ou ageusia (LIMA, 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). Figura 1: Estrutura viral do coronavírus. Fonte: MINGARRO, 2020. 10 5. DIAGNOSTICO LABORATORIAL PARA COVID-19 Testes Laboratoriais para diagnosticar o SARS-CoV-2 por meio das seguintes técnicas: • Testes de biologia molecular: RTPCR, que detectam RNA viral; • Teste de saliva molecular RT- LAMP; • Testes sorológicos que detectam anticorpos (IgA, IgG, IgM) produzidos como resposta do organismo à infeção pelo vírus; • Testes de antígeno que detectam proteínas, especificamente proteínas da superfície do vírus. • Testes de anticorpos neutralizantes, detecta imunidade pós-infecção e pós-vacinação. Os testes apresentam indicações e utilizações clínicas distintos, visto que os novos casos diagnosticados pela infecção do SARS-Cov-2 deve ser realizado por biologia molecular (RT-PCR). Os resultados de todos os testes são, entretanto, importantes, na implantação de medidas de contenção e decisões pertinentes à saúde pública (MAGALHÃES, 2020). Este estudo contém os principais testes utilizados para o diagnóstico de COVID- 19, existindo atualmente outros testes no mercado para tal diagnóstico. 5.1 TESTE DE BIOLOGIA MOLECULAR O teste padrão ouro, segundo a OMS (Organização Mundial de Saúde), é o RT- PCR (Transcrição Reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase), uma técnica de alta especificidade que tem por objetivo identificar cópias do genoma RNA do SARS- CoV-2 em amostras do trato respiratório (nasofaringe e de orofaringe) de casos suspeitos de COVID-19 (figura 2) (FIUZA et al., 2020). Figura 2: Esquema coleta de secreção em nasofaringe. Fonte: https://www.nupad.medicina.ufmg.br/doencas-infecciosas/instrucoes-coleta-covid-19 11 Certas viroses, como o SARS-Cov-2 contém somente RNA como o material genético, consequentemente é necessário realizar a conversão do RNA em DNA (Figura 4) (IAEA, 2020 apud VELOZO et al., 2021). O diagnóstico do novo coronavírus é realizado por meio da técnica de biologia molecular RT-PCR, uma técnica decorrente do PCR convencional. Usando, além dos itens do PCR convencional, a enzima transcriptase reversa um marcador radioisótopo que ocasiona fluorescência no decorrer dos ciclos da PCR. Esta técnica possibilita que os cientistas observem o resultado quase em seguida a ocorrência do procedimento por meio da análise da fluorescência em um computador que rastreia a quantidade de fluorescência a cada ciclo. Já a RT-PCR convencional só possibilita a visualização do resultado ao final da amplificação por meio da Eletroforese (IAEA, 2020 apud VELOZO et al., 2021). A técnica de RT-PCR é de alta sensibilidade e especificidade, com resultado em torno de três horas. O diagnóstico através da técnica de RT-PCR é aconselhado, entre o 3º e 4º dia da doença, podendo se prolongar até o 10º dia (VELOZO et al., 2021). A especificidade é de 100%, sua sensibilidade varia conforme o tipo de secreção respiratória analisada: Lavado broco alveolar 93%, escarro 72%; swab nasal 63% e swab nasofaringe 32% (CURY et al., 2020). Embora considerado a técnica mais eficaz de detecção, é preciso ter em mente que o resultado negativo em RT-PCR não exclui totalmente a probabilidade de infecção pelo vírus, sendo aconselhado que o resultado seja associado com observações clínicas, histórico do paciente e informações epidemiológicas da região. Caso o paciente manifeste alta probabilidade de infecção e, mesmo assim, o teste seja negativo, é aconselhado realizá-lo novamente com amostras diferentes (NOGUERIRA et al., 2020). Figura 3: Ensaios de RT-PCR para detecção de infecção por SARS-CoV-2. Fonte: KEVADIYA et al., 2021. 12 5.2 TESTE RT-LAMP O embasamento para este recente teste da saliva é a técnica molecular nomeada RT-LAMP (sigla em inglês de transcrição reversa seguida por amplificação isotérmica mediada por alça), a qual tem certas relações com a técnica de RT-PCR. No qual as técnicas são induzidas a reações para a execução de uma fase de transcrição reversa (RT), onde o RNA do vírus é transformado em DNA, e uma fase de amplificação, onde o local específico do vírus são replicados milhões de vezes para que o patógeno consiga ser identificado. Contudo, o RT-LAMP não necessita da extração do RNA do vírus para o diagnóstico, e a coleta é recomendada nos primeiros 7 dias de doença. Além disso, o RT- LAMP dispensa o uso de aparelhos complexos, como o termociclador em tempo real, usado para amplificar e detectar o RNA por meio da exposição do material a diversas temperaturas. As vantagens do RT-LAMP, envolvendo a utilização da saliva coletada pelo próprio paciente como material para o exame, a eliminação da fase de extração do RNA, e a chance de realização de amplificação do material viral em temperatura fixa (65°C), auxiliam para a simplificação do método e redução do custo (FAPESP, 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). A reação da técnica RT-LAMP pode ser colorimétrica onde a medição do pH é realizada com o corante vermelho de fenol. Quando o pH está entre 8,2-8,6, a amostra ficará rosa, o que significa que o resultado é negativo, e quando o pH se tornar mais ácido, a amostra ficará amarela, o que significa que o teste é positivo. O que muda o pH é a atividade da DNA polimerase, ou seja, enquanto o DNA polimerase está ativo, ela diminui o pH. Isso mudará a cor do vermelho fenol de rosa para amarelo, tornando o teste positivo e indicando a presença de vírus na amostra (figura 4). O ensaio colorimétricoRT-LAMP pode amplificar o gene alvo e fornecer interpretação visual em 60 min a 65 ° C, os resultados mostram uma alta sensibilidade de 95,74% especificidade de 99,95% (ESCOBAR-MUCIÑO et al., 2020). 13 Figura 4: Teste e leitura colorimétrica RT-LAMP. Fonte: BEN-ASSA et al., 2020. 5.3 TESTE SOROLÓGICOS A infecção COVID-19 também é capaz de ser detectada indiretamente pela presença de anticorpos guiados contra o SARS-CoV-2. Alguns grupos de anticorpos (imunoglobulinas) estão envolvidas na resposta imunológica, destacando as classes IgM, IgA e IgG. O diagnóstico sorológico é importante na descrição de quadros infecciosos de natureza leve a moderada. A sorologia além do mais é importante para entender os fatores epidemiológicas da doença, por meio dos inquéritos soro epidemiológicos, identificando pessoas transmissoras assintomáticos, contactantes e indivíduos eventualmente protegidos da infecção (CODAGNONE et al., 2020). O que se tem usado, tendo em vista o diagnóstico virológico são testes com princípios imunológicos para identificação da COVID-19. São os testes de ELISA, teste rápido/imunocromatografia e quimiluminescência. Nessas técnicas, utilizam-se alguns fluídos corporais como o plasma sanguíneo, o próprio sangue, lavado bronco alveolar e pesquisa direta em material oriundo nasofaringe e de orofaringe (XU W, 2020 apud RIBEIRO et al., 2020). Os anticorpos IgM são marcadores de uma infecção recente, um estágio inicial da infecção, e o paciente positivo pode estar nas fases aguda e replicativa, na fase de convalescência ou recuperado, pois o tempo de detecção do IgM pode ocorrer entre a 3° 14 e 4° semana e após a 5° semana começa a diminuir seus níveis no organismo, quase desaparece por volta da 7ª semana. Os anticorpos da classe IgG são marcadores de infecções anteriores, anticorpos de memória relacionados à imunidade que estão presentes em pacientes recuperados e podem persistir por longos períodos ou mesmo por toda a vida, mas no caso de COVID-19, esse período ainda não foi determinado o tempo de detecção do IgG é aproximadamente até o 14° dia da infecção variando do 10° ao 18° dia. Os anticorpos da classe IgA estão mais frequentemente presentes nas superfícies mucosas, protegem a imunidade, neutralizam toxinas e vírus no trato respiratório e gastrointestinal, são detectáveis após o 1º dia de sintomas, possuem especificidade menor em comparação aos testes com IgG (FIUZA et al., 2020). Em um estudo feito por Pinto et al. (2020), demostrou que a sensibilidade da detecção de IgM variou entre 44,4% e 90,4%, e a especificidade variou entre 81,2% e 100%. Para a IgG, a sensibilidade variou entre 71,4% e 99,7%, e a especificidade variou entre 90,9% e 100%. A detecção de IgA, apresentou sensibilidade de 93,3% e especificidade de 100%. A sensibilidade dos testes sorológicos para detecção de IgG e IgM simultaneamente variou entre 81,5% e 88,6%, e a especificidade entre 90,6% e 100%. 5.4 TESTE AUTOMATIZADO DE ELISA Os testes automatizados são processados em laboratórios, utilizando equipamentos analíticos para a detecção e quantificação de antígenos e anticorpos em sangue total, soro ou plasma. Entre as principais técnicas utilizadas estão ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Quimioluminescência e Eletroquimioluminescência. O teste de ELISA é o mais utilizado e baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações enzimáticas (teste imunoenzimático), sendo a enzima peroxidase a mais usada neste teste (ROITT; DELVES, 2019 apud NASCIMENTO et al., 2020). O ensaio de ELISA proporciona a detecção sensível e específica de anticorpos anti-SARS-Cov-2 IgA, IgM e IgG, por meio do uso da proteína estrutural recombinante S1 do SARS-Cov-2 usada como antígeno. Assim, ao antígeno do SARS-Cov-2 imobilizado em placa (fase sólida) é inserido o soro do paciente e, caso a amostra seja positiva, anticorpos específicos se ligam aos antígenos da placa. Em seguida, é acrescentado o anticorpo secundário contra as imunoglobulinas do soro do paciente, o qual está combinado à enzima peroxidase, com início da adição do substrato para a 15 enzima (H2O2) acontece uma reação colorimétrica. A intensidade da cor produzida é proporcional ao acúmulo de anticorpos na amostra do soro, sendo medida a partir de leitura em espectrofotômetro. Com base nos dados de absorbância adquiridos é possível então indicar o título de anticorpos anti-SARS-Cov-2 presentes no soro do paciente (EUROIMMUN, 2020; DIAS et al., 2020 apud NASCIMENTO et al., 2020). Além do mais, tem a vantagem da velocidade dos resultados, tem custo relativamente baixo. O tempo médio de detecção de anticorpos em relação a infecção por SARS-CoV-2 é de cinco dias (intervalo interquartil 3-6 dias), ao mesmo tempo que o IgG pode ser detectado em menos de 14 dias (10-18 dias) depois do início dos sintomas (WHO, 2020 apud RIBEIRO et al., 2020). 5.5 TESTE RÁPIDO IMUNOCROMATOGRAFICO O Teste rápido ou imunocromatografia da COVID-19 oferece uma velocidade importante, visto que sua leitura acontece entre 15 e 30 minutos (ELISA de 1 a 2 horas), contribuindo para a triagem do paciente por causa da alta taxa de infectividade do vírus deve ser rapidamente isolado dos demais (MAGNO, 2020 apud RIBEIRO et al., 2020). O antígeno ou anticorpo é ligado à membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é impedido por uma proteína neutra, como no imunoensaio enzimático (ELISA). Os anticorpos ligados à linha de captura podem ser utilizados para detectar antígenos, e o segundo anticorpo conjugado com corante é utilizado como um conjugado. Uma das técnicas imunológicos desses testes usa um corante insolúvel, como ouro coloidal (rosa) ou prata coloidal (azul marinho) como descobridor da interação antígeno-anticorpo. No caso do teste para COVID-19, utiliza-se uma lâmina de nitrocelulose. A amostra usada se liga ao conjugado colorido e depois da migração por cromatografia a formação de um imunocomplexo é apresentada pela deposição de um corante coloidal na linha de captação (MS, 2020 apud RIBEIRO et al., 2020). Ainda que os testes rápidos mostrem boa acurácia diagnóstica em pacientes com tempo de progresso do quadro superior a 8 dias, o tempo de janela imunológica reduz a sensibilidade destes testes quando utilizadas em fases mais precoces, o que explica o uso concomitante de outros testes de diagnóstico, como o RT-PCR, nas fases iniciais da doença (NASCIMENTO et al., 2020). 16 Figura 5: Teste sorológico do SARS-CoV-2 FONTE: KEVADIYA et al., 2021. 5.6 TESTE DE ANTIGENO Testes de detecção de antígenos virais (TRAg), esses testes pesquisam proteínas virais específicas do SARS-CoV-2 e são predominantemente imunocromatográficos. São técnicas qualitativas de rastreio rápido, 10-30 minutos, e a informação quanto o seu desempenho clínico ainda é diminuída. Possibilitam o diagnóstico prematuro da doença em fase aguda e apontam boa performance especialmente em sintomáticos (OLIVEIRA, 2020). Neste ensaio, o antígeno presente na amostra se liga a anticorpos que são fixados em uma tira de papel envolta em um filme plástico. Esta reação cria um sinal detectável visualmente. Os antígenos detectados são expressos apenas quando o vírus está se replicando ativamente, portanto, os testes podem ser usados para identificar a infecção aguda ou precoce (KEVADIYA et al., 2021). São essenciais para conter cadeias de transmissão e deve-se realizar em suspeitos nos primeiros 5 dias após o contato, para reduzir o risco de falsos negativos (Xavier et al., 2020). O teste realiza-se em amostras respiratórias, frequentemente orofaríngeas ou nasofaringes (ALMEIDA et al., 2021). O teste de antígeno tem uma sensibilidade de 96,52% e uma especificidade de 99,9% (ECO DIAGNÓTICA).17 Figura 6: Teste de detecção de antígeno. Fonte: ECO DIAGNÓTICA. 5.7 TESTE DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES Acredita-se que os anticorpos neutralizantes sejam o principal correlato da imunidade protetora e do sucesso da vacinação. Na infecção por SARS-CoV-2, esses anticorpos reconhecem regiões múltiplas dentro da glicoproteína da espícula, principalmente, mas não exclusivamente, receptor binding domain (RBD), e inibem a infectividade viral por vários mecanismos, incluindo o bloqueio da ligação inicial da espícula ao ACE-2. Duas principais regiões de suscetibilidade foram identificadas na proteína Spike, o RBD e o domínio N-terminal adjacente (NTD). O SARS-CoV e o SARS-CoV-2 têm 80% de homologia e compartilham aproximadamente 75% da sequência da glicoproteína da espícula. Embora poucos anticorpos com atividade de neutralização cruzada entre SARS-CoV e SARS-CoV-2 tenham sido identificados, a existência de anticorpos potencialmente reativos cruzados abre novos caminhos para o desenvolvimento potencial de vacinas pan-neutralizantes contra vários coronavírus (CARRILLO et al., 2021). Os anticorpos neutralizantes são detectados em cerca de 40% -70% das pessoas infectadas, dependendo dos critérios e da coorte analisados. Pelo menos 30% dos pacientes não apresentam níveis detectáveis de anticorpos e menos de 15% atingem altos 18 títulos de neutralização in vitro. Foi observada uma associação entre o título de anticorpos neutralizantes e a gravidade da doença COVID-19, e aqueles que apresentam sintomas leves ou são assintomáticos têm maior probabilidade de produzir uma resposta neutralizante. A atividade neutralizante é demonstrada aproximadamente 6 a 15 dias após o início dos sintomas, embora com uma ampla gama de títulos. Depois disso, os níveis de anticorpos neutralizantes diminuem gradualmente ao longo de um período de 3 meses com uma meia-vida estimada de 26 dias, embora esses dados precisem ser confirmados em análises longitudinais maiores (CARRILLO et al., 2021). Uma alternativa ao teste de neutralização é a utilização de métodos imunoenzimáticos tradicionais como Elisa e quimioluminescência utilizando amostras de soro e plasma, nos quais a intensidade do valor medido apresentou boa correlação com os títulos de anticorpos neutralizantes (SANTISA et al., 2020). Para preparar a amostra deve-se pipetar 200ml do tampão de extração e transferir para o microtubo (1,5mL), logo após é adicionado 100mL de soro ou plasma ao microtubo contendo o tampão de extração. Dissolver as esferas liofilizadas da pipeta Spoit completamente no tampão de extração. Em seguida incubar a amostra e o tampão a temperatura de 37ºC por 20 min. Após a amostra ser incubada por 20 min, pipetar 100 mL da mistura da reação no dispositivo teste. Antes do dispositivo teste ser colocado no analisador, deve-se deixar o dispositivo fora por 15 min (ECO DIAGNÓTICA). Figura 7: Procedimento e leitura do teste imunoensaio fluorescente. 19 Fonte: ECO DIAGNÓTICA. Interpretação dos resultados: se a inibição neutralizante for maior que 20%, resultado positivo e anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 detectado, se a inibição neutralizante for menor que 20% resultado negativo e anticorpo neutralizante contra SARS-CoV- 2 não detectado (ECO DIAGNÓTICA). 6. DEMAIS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS A análise laboratorial dos pacientes acometidos pela COVID-19, mostrou uma série de motivos característicos e capazes de apontar um progresso prejudicial à doença, entre eles podemos apontar alterações hematológicas, bioquímicas, marcadores teciduais e de resposta inflamatória sistêmica. A infecção pelo SARS-CoV-2 provoca uma intensa e duradoura resposta por diferentes citocinas inflamatórias em alguns indivíduos, efeito chamado como tempestade inflamatória. Essa resposta exacerbada induz a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e disfunção de múltiplos órgãos, sendo capaz de levar à deterioração e morte desses indivíduos (YE Q, et al., 2020 apud CARVALHO et al., 2020). As alterações laboratoriais mais comuns em pacientes com COVID-19 são aumento de 75%-93% da proteína C reativa (PCR) com diminuição da albumina sérica em 50%-98% e contagem total de leucócitos com significativa alteração, de acordo com relatos na literatura, algumas vezes apresentando uma elevação ou diminuição, mas com 20 evidente presença de linfopenia (35%-75%). Há também diminuição da hemoglobina de cerca de 41% a 50% e aumento da taxa de sedimentação de eritrócitos (VHS) em 15%- 85%, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) de cerca de 8%-37% e lactato desidrogenase (LDH) por volta de 12%. Os valores dos biomarcadores associados com infecção, incluindo PCR, procalcitonina (PCT) e VHS, aumentam gradualmente à medida que o estado clínico se deteriora, além de dímero-D, creatina quinase (CK), fração MB da creatina quinase (CK-MB), LDH, ALT, AST, ureia, creatinina, troponina cardíaca e proteína amiloide sérica A (SAA) (XAVIER et al., 2020). Tabela1: Alterações laboratoriais, observadas na grande maioria dos pacientes acometidos pela covid-19. AUTOR TÍTULO TIPO DE TESTE DESCRIÇÃO Almeida- Júnior et al., (2020) Covid-19 e a infecção por SARS-CoV-2 em um panorama geral Hemograma (Série vermelha) Observada microcitose e redução dos índices de hemoglobina. Brito et al., (2020) Pandemia da Covid-19: o maior desafio do século XXI Leucograma Na análise de pacientes com covid- 19, tem se notado linfopenia evidente com posterior leucocitose. Lippy & Henry (2020) A trombocitopenia está associada a infecções graves por doença de coronavírus (Covid-19): uma metaanálise Plaquetograma Observados quadros de trombocitopenia em 55% dos casos avaliados. Velavan & Meyer (2020) The Covid-19 epidemic Proteína C-reativa Significativa elevação das concentrações, o que 21 é típico de processos infecciosos e inflamatórios. Lippi et al., (2020) Procalcitonin in pacients with severe coronavirus disease 2019 (COVID- 19): A meta-analysis Procalcitonina Mostra-se em elevação para os casos de Covid-19. Mardani et al., (2020) Parâmetros laboratoriais na detecção de pacientes COVID-19 com RT- PCR positivo: um estudo de precisão de diagnóstico Aspartato Aminotransferase (ALT) e Alanina Aminotransferase (AST) Taxas elevadas esse marcador hepático, favorecendo para os indícios de lesão nesse órgão. Pimentel et al., (2020) A disseminação da covid19: um papel expectante e preventivo na saúde global Lactato Desidrogenase (LDH) Altos índices de lactato Desidrogenase nos pacientes com confirmação para covid19. Vuorioet al., (2020) Familial hypercholesterolaemia and COVID‐19: triggering of Lipoproteína de baixa densidade (LDL) Aumento na mensuração desta nas concentrações sanguíneas. Jiang et al., (2020) Recurrent PCR positivety after hospital discharge of people with coronavirus Albumina Diminuição significativa dessa globulina e demais circulantes. 22 disease 2019 (COVID- 19) La Regina et al., (2020) Recomendações de segurança dos pacientes para a epidemia de Covid19 Velocidade de Hemossedimentação (VHS) Aumento da VHS em até 85% dos casos. Xiang et al., (2020) Marcadores bioquímicos potenciais para identificar casos graves em pacientes com COVID-19 Ureia, Creatinina e Cistatina C Em pacientes no estado grave da doença, as concentrações de Ureia, Creatinina e Cistatina C, mostraram-se significativamente maiores, quando comparado aos casos leves. Nascimento et al., (2020) COVID-19 e Estadode Hipercoagulabilidade: Uma Nova Perspectiva Terapêutica.Tempo de protrombina (TP), Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e Dímero-D Aumento dos valores de TP e TTPA. As dosagens do Dímero- D mostram-se em aumento progressivo, mediante exacerbação da infecção, esse aumento também, tem sido associado a taxa de mortalidade. Guo et al., (2020) Cardiovascular implications of fatal outcomes of patients Prolactina, Triglicerídeos e Troponina I Aumento de Troponina I, vinculada as lesões do miocárdio, além 23 with coronavirus disease 2019 (COVID-19) de elevação da prolactina e triglicerídeos. Fonte: Elaborado pelo autor com base em LIMA et al., 2020. 6.1 ALTERAÇÕES DOS MARCADORES LABORATORIAIS Em pacientes acometidos por COVID-19, observa-se atrofia de órgãos linfoides secundários, como linfonodos e baço, acompanhada de diminuição do número de linfócitos TCD4 e TCD8 nos folículos linfáticos. A infecção por COVID-19 também descreve necrose relacionada ao linfonodo no baço, degeneração de células esplênicas, necrose hemorrágica focal, proliferação focal de macrófagos e apoptose de macrófagos (XU et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). A linfopenia é um sinal precoce que precede os problemas pulmonares e tende a se normalizar à medida que os pacientes melhoram clinicamente. Em alguns pacientes infectados com COVID-19, os números absolutos de linfócitos TCD4, células TCD8 e NK são muito menores do que o esperado em pacientes com doença persistente grave (FATHI, REZAI, 2020 apud ERRANTE et al., 2020). A contagem de linfócitos TCD8 retorna ao normal após 2 a 3 meses, embora a contagem de linfócitos TCD4 de memória possa levar aproximadamente um ano para se normalizar (TERPOS et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). Na maioria dos casos, a leucocitose é um indicador de possível coinfecção bacteriana. Além disso, danos pulmonares graves em pacientes com SARS podem desempenhar um papel fundamental no desencadeamento de leucopenia, linfopenia e trombocitopenia (LÓPES et al., 2020). A maioria das células inflamatórias que se infiltram nos pulmões são monócitos e macrófagos, e os achados histopatológicos mostram a presença de macrófagos e células gigantes multinucleadas relacionadas a uma lesão alveolar difusa, acompanhada de pequena infiltração linfocítica (XU et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). O número de monócitos e macrófagos circulantes em tecidos inflamados está aumentado e os níveis plasmáticos de interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNF -α) são aumentados (WAN et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). Os níveis plasmáticos de IL-6, IL-8 e TNF-α e em menor grau de IL-1β estão aumentados no momento da internação e suas concentrações se correlacionam com o 24 curso da doença e mortalidade, mesmo após correção da idade, etnia, raça e comorbidades usadas como parâmetros para identificar pacientes em risco de doença grave (DEL VALLE et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). A ferritina sérica é outro parâmetro de grande importância levantado em conta nesse contexto inflamatório. Em mais de 63% dos pacientes com COVID-19, esse parâmetro foi aumentado na admissão ou durante a internação. Os níveis mais altos de ferritina foram observados em pacientes com pior prognóstico e naqueles com maiores complicações sistêmicas. Altos níveis de mediadores pró-inflamatórios, hipóxia, estresse oxidativo, entre outros, são grandes estimulantes da liberação de ferritina. Acredita-se que o aumento da ferritina seja um dos principais parâmetros associados ao agravamento da doença, pois reflete sobre a ativação de macrófagos que ocorre em pacientes com SARS-CoV-2 (LÓPES et al., 2020). Parâmetros laboratoriais elevados de CK, CKMB e mioglobina estão associados a danos miocárdicos e musculares que podem ocorrer em pacientes infectados com SARS-CoV-2. O dano ao sistema cardiovascular é multifatorial e pode resultar de um desequilíbrio de altas necessidades metabólicas e baixa reserva cardíaca na inflamação sistêmica e trombogênese, mas também pode ocorrer dano cardíaco direto pelo vírus (COSTA et al., 2020). Os níveis anormais de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), acompanhados por um ligeiro aumento da bilirrubina, foram os principais indicadores. A proporção de pacientes com lesão hepática deve-se a formas progressivas de infecção e possivelmente infecção direta de hepatócitos. Vários estudos têm mostrado que o dano aos hepatócitos foi maior em pessoas com formas mais graves da doença e, consequentemente, os níveis de transaminases e bilirrubina apresentados por essas pessoas eram mais elevados (LÓPES et al., 2020). Lesões pulmonares ou de órgãos em pacientes com COVID-19 foram associadas a níveis aumentados de lactato desidrogenase (LDH). Lesões generalizadas de órgãos, bem como lesões pulmonares, hepáticas ou miocárdicas podem ser responsáveis pelo aumento da LDH observada na doença COVID-19. O aumento desses parâmetros laboratoriais estaria associado a danos miocárdicos e / ou musculares que esses pacientes podem apresentar (LÓPES et al., 2020). O dímero-D, que é o produto da degradação da fibrina, surge por meio de três reações: pela conversão do fibrinogênio em trombina de fibrina, a reticulação da fibrina pelo fator XIII ativado da cascata de coagulação e pela degradação da fibrina pela 25 plasmina (MORENO et al, 2020). Dímero-D é um dos marcadores com a maior taxa de mortalidade em pacientes de UTI com COVID-19 (TANG et al., 2020). O desenvolvimento de coagulação intravascular disseminada (DIC) é caracterizado por tempo de protrombina prolongado e tempo de tromboplastina parcial ativada (KPTT), presença de produtos de degradação da fibrina e trombocitopenia. A tendência trombótica em pacientes com COVID-19 também está associada à ativação ou danos às células endoteliais por meio da ligação do vírus ao receptor enzima conversora da angiotensina 2 (ACE-2) (DEL VALLE et al., 2020; ZHANG et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). Anormalidades renais em pacientes infectados com SARS-CoV-2 que manifestam a forma grave da doença são um achado comum. O aparecimento e os sintomas variam desde danos estruturais leves, como a presença de proteinúria, até a ocorrência de lesão renal aguda (IRA) no contexto de falência de múltiplos órgãos. Tal como acontece com outras condições, os níveis de captação de creatinina podem nem sempre refletir a verdadeira função renal basal do indivíduo e os dados históricos de biomarcadores podem nem sempre estar disponíveis no momento da avaliação inicial. Em relação ao valor prognóstico, também foi observado que nos casos graves da doença e em pacientes com piora clínica mais grave, os níveis séricos de ureia e creatinina aumentam progressivamente dias antes do óbito (LÓPES et al., 2020). Níveis significativos de troponina-I foram encontrados em pacientes infectados com SARS-CoV-2 e com diagnóstico de miocardite (HUANG et al., 2020). As troponinas são enzimas liberadas no sangue quando as células do músculo cardíaco (miócitos cardíacos) são feridas ou mortas. Na COVID-19, o envolvimento miocárdico agudo foi descrito como dano cardíaco agudo induzido por uma possível tempestade de citocinas inflamatórias que podem ou não causar necrose das células do músculo cardíaco. O aumento da troponina foi acompanhado por um aumento em outros biomarcadores inflamatórios (dímero-D, ferritina, interleucina-6 [IL-6], lactato desidrogenase), aumentando a possibilidade de que isso possa refletir mais uma tempestade de citocinas ou linfo-histiocitose hematofagocítica secundária do que dano miocárdico isolado (FIGUEIREDO et al., 2020). Imunoglobulinas plasmáticas elevadas podem causar aumento da viscosidade sanguínea, quando os pacientes requerem o uso de ventilação mecânica eintervenções vasculares, e o cateterismo venoso central pode induzir mais dano endotelial em pacientes 26 criticamente enfermos. Níveis elevados de anticorpos anticardiolipina foram relatados em alguns pacientes (LIN et al., 2020; ZHANG et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). A combinação de todos esses fatores pode levar à trombose venosa profunda ou tromboembolismo pulmonar. Em pacientes infectados com COVID-19, a profilaxia precoce e estendida com heparina de baixo peso molecular pode ser necessário (ZHANG et al., 2020). Alterações isquêmicas nos dedos das mãos e dos pés, mimetizando vasculite, foram relatadas em pacientes com infecção grave por COVID-19 (LIN et al., 2020 apud ERRANTE et al., 2020). 27 7. CONSIDERAÇOES FINAIS A doença da COVID-19 exibe uma ampla gama de sinais e sintomas clínicos que afetam órgãos vitais como pulmões, coração, trato gastrointestinal, fígado, sistema nervoso central, sangue e rins, seus sintomas aparecem de 2 a 14 dias após a exposição podendo piorar e, em alguns casos, levar à morte. As principais técnicas aplicadas para diagnosticar a doença é RT-PCR considerado padrão ouro pela OMS, de alta sensibilidade e especificidade com diagnóstico entre o 3º e 4º dia da doença, técnica que se demostrou eficaz no estudo. Outra técnica é o RT-LAMP, com a vantagem de utilizar a saliva coletada do paciente como material de análise a partir do 7º dia do contágio e um tempo de resultado de 30 a 40 minutos. Os testes sorológicos que se destacaram no estudo trazendo suas técnicas de ELISA e teste rápido ou imunocromatografia buscando a presença de anticorpos IgA, IgM e IgG, indicado a partir do 10º dia dos sintomas, oferece uma detecção sensível e específica de anticorpos, tem a vantagem de resultados rápidos entre 15 e 30 minutos. Os testes de detecção de antígenos, técnica de rastreamento qualitativo rápido, de 10 a 30 minutos, possibilitam o diagnóstico precoce da doença na fase aguda e apresentam bom desempenho, principalmente em pacientes sintomáticos, a partir do 5º dia de infecção. Testes de anticorpos neutralizantes também se destacam no estudo pela sua eficácia, trazendo vantagens, onde vai detectar anticorpos neutralizantes contra o vírus pós- infecção e pós-vacina. Em relação às principais alterações dos marcadores laboratoriais, podemos destacar leucocitose e neutrofilia relacionadas ao processo inflamatório ou coinfecção bacteriana, linfopenia por defeitos na resposta imune e infecção viral com possível destruição de linfócitos T, trombocitopenia por coagulopatia devido a altos níveis de dímero-D. Com a progressão da doença há elevação gradual dos níveis de LDH, proteína C reativa e ferritina devido a tempestade de citocinas. Também há um aumento nos níveis séricos de CK, CKMB e troponina, que resultam de danos ao músculo cardíaco. 28 REFERÊNCIAS ALMEIDA, Elsa; SILVA, Tânia. SARS-COV-2: comparação dos diferentes testes de diagnóstico laboratorial: uma revisão adaptada à realidade portuguesa. HIGEIA- Revista Científica da Escola Superior de Saúde Dr. Lopes Dias, p. 9-17, 2021. BEN-ASSA, Nadav et al. Direct on-the-spot detection of SARS-CoV-2 in patients. Experimental Biology and Medicine, v. 245, n. 14, p. 1187-1193, 2020. 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