técnologia genética

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APS – TÉCNOLOGIA GENÉTICA
Mariana Nunes Dias
201713969
1) Como funciona a técnica de RFLP e qual a função das enzimas de restrição para o método? O vídeo a seguir poderá ajudá-lo a responder à pergunta: https://www.youtube.com/watch?v=pjrBs4ex1pU&ab_channel=J%C3%A9ssicaBomfimdeAlmeida
A técnica de RFLP funciona a partir da extração de DNA da amostra de sangue de um indivíduo acompanhado de uma adição de enzima de restrição na qual tem a importância de reconhecer sítios específicos do DNA e cortar em fragmentos. Tendo o DNA fragmentado é feito a aplicação do mesmo em gel de agarose separando o DNA por tamanho e carga, faz-se a transferência dos fragmentos para uma membrana de nitrocelulose.
Como hibridização dos fragmentos com sondas marcadas pode-se visualizar os polimorfismos através de autorradiografia e assim podendo analisar o resultado.
2) Brevemente, explique os tipos genéticos de surdez. 
A surdez hereditária não sindrômica não apresenta outro sintoma, somente a surdez, aproximadamente 70% dos casos de surdez hereditária pré-lingual são não sindrômicos. Existem muitos genes responsáveis pela surdez não sindrômica hereditária no qual apresentam padrões de herança: autossômica recessiva, autossômica dominante, ligada ao cromossomo x ou alterações no DNA mitocondrial. 
A Surdez hereditária sindrômica apresenta outros sinais ou síndromes além de perda auditiva. Em média 30% de surdez hereditária pré-lingual e pós-lingual são sindrômicas. 
3) Qual o material biológico coletado para realização do diagnóstico?
Amostras de sangue (5 ml).
 4) Quais os genes e a respectivas mutações pesquisados no artigo? 
35delG no gene GJB2 e D13SS1830 no GJB6.
5) Qual o tamanho do fragmento produzido pelo PCR do gene GJB2? 
89pb.
6) Qual a enzima de restrição utilizada na clivagem dos fragmentos de PCR do gene GJB2? Qual os tamanhos dos fragmentos para alelos mutados e não mutados? 
A enzima utilizada na clivagem foi BstNI. 
Sem a mutação os fragmentos possuem de 69 pb a 20 pb. Indivíduos homozigotos para esta mutação produzem somente um fragmento de 89 pb já os heterozigotos possuem os três fragmentos mencionados.
7) Brevemente, explique a abordagem utilizado para diagnóstico dos alelos para o gene GJB6. 
A mutação D13S1830 no gene GJB6 foi detectada pela técnica padrão de PCR com três primers, F: (TTT AGG GCA TGA TTG GGG TGA TTT), R1: (CAC CAT GCG TAG CCT TAA CCA TTTT) e R2: (TCA TCG GGG GTG TCA ACA AACA).2 A temperatura de annealing foi de 62 ◦C. Os primers R1 e R2 estão localizados no gene que codifica a proteína conexina 30 e o primer F está localizado antes da região de 342 kb, a qual é deletada em indivíduos com a mutação. O primer reverso (R2), por sua vez, está localizado próximo ao ponto de quebra do DNA na presença da mutação. Indivíduos normais que não têm a mutação formarão produtos de 681 pb amplificados pelos primers R1 e R2. Quando a deleção ocorre, a região de annealing do primer R2 é perdida, aproxima-se das regiões de anelamento dos primers F e R1, amplifica um fragmento de 460 pb. Portanto, os indivíduos heterozigotos têm fragmentos de 681 pb e 460 pb, enquanto os indivíduos homozigotos com a mutação apresentam apenas o fragmento com 460 pb. Duas mutações (35delG e D13S1830) foram rastreadas em todos os participantes.