Diagnóstico Molecular - questões

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Data: 26/11/2021 
Acadêmico: Naysa Gabrielly Alves de Andrade 
QUESTÕES – Técnicas de Biologia Molecular 
QUESTÃO 1 . A ANEMIA FALCIFORME ESTÁ ASSOCIADA A EXISTÊNCIA DE UMA MUTAÇÃO DE PONTO A 
- T, NO GENE DA Β-GLOBINA QUE OCASIONA, NA PROTEÍNA, A TROCA DO AMINOÁCIDO GLU POR VAL. 
ESTA MUTAÇÃO ELIMINA UM SÍTIO RECONHECIDO PELA ENZIMA DE RESTRIÇÃO MST II. O DESENHO 
ABAIXO REPRESENTA UM ESQUEMA DOS GENES SELVAGEM E MUTANTE. O DNA DE UMA PESSOA 
NORMAL FOI EXTRAÍDO, DIGERIDO COM A ENZIMA MST II, FRACIONADO POR ELETROFORESE E 
SUBMETIDO A “SOUTHERN BLOT”. A SONDA UTILIZADA NA HIBRIDAÇÃO FOI O SEGMENTO DE 1,3 KB 
INDICADO NA FIGURA ABAIXO. 
 
a) Planeje um teste utilizando a técnica de "Southern blot" para o diagnóstico pré-natal desta doença. Faça o 
esquema do resultado esperado considerando um feto normal e de um portador da doença cujos pais são 
heterozigóticos. 
Feto normal  2 
Portador da doença  3 
Pais heterozigotos  4 
 
b) Complete na figura o padrão 
de bandas esperado para o DNA 
de: 
b.1) pessoa homozigótica para a 
mutação de ponto que causa a 
anemia falciforme.  3 
b.2) Pessoa heterozigótica para 
a mutação  4 
 
AA 
Highlight
Highlight
Highlight
Highlight
Mutante
Normais
2 --> normal
3 --> afetado 
4 --> pais
 
 
QUESTÕES 2 : 
2.1. EXPLIQUE O PROCESSO DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA PELA REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA 
(PCR). 
A PCR é uma técnica da biologia molecular para amplificar uma única ou poucas cópias de um pedaço de 
DNA e baseia-se no processe de replicação do DNA que ocorre in vivo 
Durante o PCR elevadas temperaturas separam as moléculas de DNA em 2 cadeias simples, permitindo 
então a ligação de oligonucleotídios iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente 
constituídos por 15-30 nucleotideos, obtidos por síntese química 
Os 2 pares de primers são acrescentados na reação 
Se a determinada sequência estiver presente na amostra, ela será multiplicada milhares de vezes, 
podendo configurar uma reação positiva 
 
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos 
Os ingregientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam 
por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado 
As etapas básicas são: 
 Desnaturação  aquece fortemente a reação para separar ou desnaturar as fitas de DNA, isso 
proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa 
 Anelamento  resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências 
complementares no DNA molde de fita simples 
 Extensão  eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, 
sintetizando novas fitas de DNA 
Este ciclo se repete 25- 35x em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 - 4h, dependendo 
do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de 
interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões 
2.2. QUAL A FUNÇÃO DOS PRIMERS NA TÉCNICA DA PCR? 
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um 
primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA 
 
 
Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, 
pelos primers que ele escolher 
Os primers são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 20 nucleotídeos de 
complimento 
2 primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de 
interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas 
do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada 
Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares 
 
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está 
entre eles será copiada 
 
2.3. CITE PELO MENOS TRÊS APLICAÇÕES DA TÉCNICA DA PCR 
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é pequena 
 
 
Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, em que pequenas amostras de DNA retiradas 
da cena de um crime são aplificadas para serem analisadas 
A PCR também é utilizada para a detecção de microrganismos infecciosos, testes de paternidade ou 
qualquer outro procedimento em que se estude um fragmento genético 
QUESTÕES 3 : 
O que são enzimas de restrição? 
Existem 4 tipos de enzimas de restrição, classificadas de acordo com o número de subunidades, tipo de 
clivagem, grau de especificidade e requerimento de cofatores 
As enzimas tipo II clivam a dupla hélice de DNA em sítios específicos e reconhecem sequências 
particulares de DNA, geralmente de 4, 5 ou 6 pares de bases de comprimento, chamados de sítio de 
reconhecimento 
A clivagem ocorre em uma posição definida dentro dessa sequência 
Algumas enzimas deixam extremidades cegas, outras deixam extremidades coesivas 
 Extremidades cegas  duplas fitas de ácidos nucleicos sem nucleotídeos não pareados nas 
extremidades 
 Extremidades coesivas  duplas fitas de ácidos nucleicos com nucleotídeos não pareados na 
extremidade de uma das fitas 
 Palíndromos  sequências que são iguais nas duas fitas quando são lidas na mesma direção 
A formação de extremidades coesivas é de grande importância para a ligação de sequências específicas 
de DNA por complementaridade 
Os sítios de reconhecimento geralmente formam palíndromos 
As enzimas de restrição foram incialmente isoladas de bactérias, que utilizam essas enzimas como um 
meio de proteção para DNA invasor, atualmente muitas enzimas de restrição são sintetizadas em 
laboratório por técnica de engenharia genética 
Algumas enzimas apresentam atividade fora de seu sítio de reconhecimento, conhecida como star activity, 
por isso foram desenvolvidas enzimas de alta fidelidade em laboratório. Além disso, também foram 
desenvolvidas enzimas com novos sítios de clivagem e que clivam apenas uma das fitas de DNA 
Uma enzima de restrição muito conhecida é a EcoRI, isolada da bactéria Escherichia coli, essa enzima 
reconhece o sítio 5'-GAATTC-3' e corta o DNA formando extremidades coesivas 
 
 
 
 
 
 
QUESTÕES 4 : O CROMATOGRAMA DA FIGURA 1 FOI OBTIDO A PARTIR DA ANÁLISE DOS 
FRAGMENTOS DE DNA AO LADO, QUANDO ESTES PASSARAM POR UM SENSOR CAPAZ DE DETECTAR 
CORES DIFERENTES. EM QUE ORDEM VOCÊ ESPERA QUE ELES TENHAM PASSADO PARA PRODUZIR TAL 
RESULTADO? 
 
NNN748210126111593 
Azul claro  iniciador de sequenciamento 
Fazer o sequenciamento por cor e a maior base vem primeiro (fazer de traz para frente) 
QUESTÕES 5: CONCEITUE TERAPIA GÊNICA, RELACIONANDO VANTAGENS E DESVANTAGENS. 
A terapia gênica está baseada no conceito de que uma doença genética pode ser corrigida pela substituição 
ou adição do gene defeituoso 
O termo terapia gênica pode ser definido como a transferência de material genético para dentro das 
células de um indivíduo com o objetivo de conferir um benefício terapêutico 
 
 
 
 
 
 
 
QUESTÕES 6: A PEDIDO DE UM LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS VOCÊ DESENVOLVEU UM PCR 
PARA IDENTIFICAR SE UM INDIVÍDUO É PORTADOR SÃO DE UMA DOENÇA GENÉTICA. PARA TAL VOCÊ 
AMPLIFICA UMA REGIÃO DO GENE DE INTERESSE E EM SEGUIDA CORTA O PRODUTO DO PCR COM 2 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO DIFERENTES. CADA UMA RECONHECE UM SÍTIO QUE SÓ EXISTE NOS ALELOS 
MUTANTES. UMA ÚNICA MUTAÇÃO É SUFICIENTE PARA ELIMINAR A FUNÇÃO DO PRODUTO GÊNICO. 
O ESQUEMA ABAIXO MOSTRA AS VÁRIAS POSSIBILIADADES DOS RESULTADOS. EXPLIQUE-O 
DETALHADAMENTE. 
Portador são = heterozigoto 
Homozigoto normal  tem o fragmento mais 
pesado  AA 
Portador são 1  AB 
Portador são 2  AC 
Afetado 1  BC 
Afetado 2  CC 
Afetado 3  BB 
Grupo A  frag. Único 
Grupo B  tem o mesmo comprimento, mas com sítio de restrição 
Grupo C  mesmo tamanho, mas comsítio de restrição no meio