Criopreservação - métodos e cálculos para o congelamento se sêmen

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Após a coleta do sêmen existem muitas formas de preservá-
lo até o momento de o utilizar. Dentre as técnicas está a 
criopreservação (que é o congelamento), que também conta 
com muitas formas de ser feito, e dentre elas estabelece-
se o seguinte padrão: 
1. Volume 
2. Concentração 
3. Motilidade retilínea progressiva (MRP) 
Para calcular quanto precisamos em volume, a 
concentração etc. devemos seguir alguns cálculos.... 
1) descobrir a concentração total do sêmen: 
[] total = concentração/ml . volume total 
Um equino ejaculou 120ml e tem concentração de 
130x10^6 sptz/por ml”.
[] total = 130x10^6 . 120 = 15,6x10^9 sptz 
2) Calcular a [] de espermatozoides vivos: 
Devemos lembrar que do valor da concentração total, nem 
todos os espermatozoides estão vivos e viáveis, e para chegar 
ao oócito precisam ter a motilidade retilínea progressiva 
(MRP). Portanto, iremos calcular a [] de espermatozoides 
vivos a partir do seu MRP. 
 “ Um equino com sêmen de MRP 80% e concentração 
total de 15,6x10^9 tem uma concentração de espermatozoides 
viáveis de.......” . 
[] sptz vivos = concentração total de sptz . MRP 
[] vivos = 15,6x10^9 . 0,8 (80%) = 12,48x10^9 sptz vivos e viáveis. 
3) Perca de 50%: 
Quando congelamos o sêmen, naturalmente há a perda de 
espermatozoides durante o processo. Assim, consideramos que 
50% deles irão morrer. 
[] de sptz para congelar = sptz os vivos / 2 
• 50¨% --vivo 
• 50% -- morto 
 “Um equino com sêmen de concentração de 
espermatozoides vivos em 12,48x10^9 terá quantos 
espermatozoides vivos para congelar?” 
12,48x10^9 / 2 = 6,24x10^9 sptz p/congelar 
 
 
 
 
 
 
 
4) palhetas: 
O sêmen deve ser congelado em palhetas 
• Todas as espécies: cada palheta tem 100 milhões 
de espermatozoides 
• Bovinos: cada palheta tem 20 milhões de 
espermatozoides 
Quantidade de palhetas = espermatozoides disponíveis para 
congelar / 100 milhoes 
 “um equino com 6,24x10^9 sptz disponíveis para 
congelar terá a formação de quantas palhetas?” 
6;240.000.000. / 100.000.000 = 62,4 palhetas 
Como não há essa quantidade de palheta, arredondamos 
SEMPRE para baixo, no caso, seriam 62 palhetas. Essa 
quantidade de sêmen que sobra não deve ser jogada fora, 
apenas colocamos a mais, espalhando o que sobrou nas 
demais palhetas. 
5) Volume: 
Para preencher a quantidade de palhetas que vamos 
precisar, necessitaremos de uma quantidade de volume de 
sêmen. 
• Todas as espécies: em cada palheta cabe 0,5 ml 
• Bovinos: cada espécie cabe 0,25ml 
Volume (em ml) = número de palhetas . 0,5 
 “Para congelar o sêmen de um equino que precisará 
de 62 palhetas sendo formadas, qual o volume necessário 
de ejaculado?” 
62 x 0,5 = 31 mls. 
Caso esse número fosse de 31,5, por exemplo, não 
arredondaríamos, usaríamos esse valor mesmo, visto que esse 
“0,5” restante é o suficiente para preencher uma nova 
palheta. 
6) Diluição: 
Agora, por fim, devemos calcular quanto de diluidor tem que 
ser adicionado para completar esse volume, e quanto de 
sêmen será necessário. O diluidor é essencial pois ele nutre e 
protege o espermatozoide. 
 “Um equino ejaculou 120 ml de sêmen, e precisa de 
um volume de apenas 31 ml para preencher 62 palhetas. 
Qual o valor de diluente?” 
Nesse caso, o equino é uma espécie que tem grande 
quantidade de ejaculado. Ele ejaculou 120 ml, porém, 
precisamos de apenas 31. Como reduzir o volume de 120 para 
31 ml, visto que sobraria muito? 
do sêmen 
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Colocamos esses 120 ml em uma centrifuga que irá lançar 
os espermatozoides para a ponta do tubo, separando-os da 
parte seminal líquida. Dessa forma concentraremos os 
espermatozoides e os separaremos da parte liquida, e assim 
podemos reduzir o volume de 120 ml sem perder a 
quantidade original que tinha de espermatozoides 
A separação de parte líquida para a parte com 
espermatozoides é visível a olho nu. Para tirar essa porção 
indesejável tiramos ou a parte liquida maior com uma 
seringa ou a porção de células com uma pipeta apertada. 
• Sobrenadante: porção líquida superficial (plasma 
seminal + diluidor) 
• Pellet: espermatozoides que estão concentrados no 
fundo do tubo 
Geralmente um pellet tem de 1 a 5mls. 
Para o nosso exemplo, considerando o pellet de 5 ml, 
adicionamos mais 26mls de diluidor para totalizar os 31 ml 
necessários para nossas 62 pipetas. 
Isso só acontece quando o volume necessário for menor que 
o ejaculado, o que ocorre em espécies que tem o sêmen muito 
diluído e em grande quantidade (suínos, equinos e cães). Para 
as demais espécies, com pouco ejaculado, apenas adicionamos 
a quantidade de diluidor que falta para completar o 
volume desejado 
Exercício 1: 
^
%
• Descobrir a concentração total: 
[] total = concentra/ml . volume total 
[] total = 4,4x10^9 . 1,5 
[] total = 6,6x10^9 sptz 
 
• Cálculo da porção que está viva: 
MRP = 70% 
Se o total é de 6,6x10^9, fazemos: 
6,6x10^9 . 0,7 (70%) = 4,62.x10^9 sptz vivos e viáveis. 
 
• Porém, no processo de criopreservação apenas 50% 
deles estarão vivos: 
4,62x10^9 / 2 = 2,31x10^9 sptz para congelar 
• Em cada palheta cabe 100 milhões de 
espermatozoides, portanto: 
2.310.000.00 / 100.000.000 = 23,1 palhetas possíveis de serem 
formadas. Porém, não conseguimos formar essa quantidade 
de palheta, então usaremos o 23. 
• Precisamos de 23 palhetas, e cada uma delas terá 
0,5ml. Portanto, precisamos descobrir o volume de 
material necessário 
23 . 0,5 = 11,5 mls 
• Agora, precisamos lembrar que o animal ejaculou 
1,5ml, porém, precisamos de 11,5 para preencher as 
palhetas. 
Para completar a quantidade necessária, adicionaremos 
10mls de diluente. 
Exercício 2: 
^
%
• Nesse caso, já sabemos o valor da concentração 
total, que é 2,3x10^9 sptz. 
• Cálculo da porção que está viva: 
MRP = 80% 
Se o total é de 2,3x10^9, fazemos: 
2,3x10^9 . 0,8 (80%) = 1,84x10^9 sptz vivos e viáveis. 
 
• Porém, no processo de criopreservação apenas 50% 
deles estarão vivos: 
1,84x10^9 / 2 = 920x10^6 sptz para congelar 
• Em cada palheta cabem 100 milhões de 
espermatozoides, portanto: 
920.000.000 / 100.000.000 = 9,2 palhetas possíveis de serem 
formadas. Porém, não conseguimos formar essa quantidade 
de palheta, então usaremos o 9. 
• Precisamos de 9 palhetas, e cada uma delas terá 
0,5ml. Portanto, precisamos descobrir o volume de 
material necessário 
9 . 0,5 = 4,5 
• Agora, precisamos lembrar que o animal ejaculou 
6ml, porém, precisamos de 4,5 para preencher as 
palhetas. 
Teremos que fazer a centrifugação, e nesse exemplo 
consideramos o pellet como 0,5mls. 
4,5mls necessários para preencher as 9 palhetas – 0,5mls de 
pellet = 4mls de diluente necessários, ou: 
4ml de diluente + 0,5 mls de pellet = 4,5 volume total 
necessário 
 
Exercício 3: 
^
%
• Descobrir a concentração total: 
[] total = concentra/ml . volume total 
[] total = 80x10^6 . 100 ml 
[] total = 8x10^9 sptz 
 
• Cálculo da porção que está viva: 
MRP = 90% 
Se o total é de 8x10^9, fazemos: 
8x10^9 . 0,9 (90%) = 7,2.x10^9 sptz vivos e viáveis. 
 
• Porém, no processo de criopreservação apenas 50% 
deles estarão vivos: 
7,2x10^9 / 2 = 3,6x10^9 sptz para congelar 
• Em cada palheta cabe 100 milhões de 
espermatozoides, portanto: 
3.600.000.00 / 100.000.000 = 36 palhetas possíveis de serem 
formadas. 
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• Precisamos de 36 palhetas, e cada uma delas terá 
0,5ml. Portanto, precisamos descobrir o volume de 
material necessário 
36 . 0,5 = 18mls 
• Agora, precisamos lembrar que o animal ejaculou 
100ml, porém, precisamos de apenas 18mls para 
preencher as palhetas. 
Considerando o pellet como 5mls, sabemos que essa é a 
porção que temos de espermatozoides, e, portanto, para 
completar os 18mls de volume total para preencher as 36 
palhetas, precisamos de 13mls de diluente. (5 + 13 = 18) 
 
Manejo do sêmen para o congelamento: 
 
1) identificar a palheta: 
Devemos escrever as informações importantes com caneta 
esferográfica ou através de uma impressoraespecifica na 
palheta 
• Nome 
• Raça 
• Registro genealógico 
• Partida: inclui todos os sêmen que foram 
manuseados naquele momento, indicando a mesma 
qualidade para todos do lote, devem ser da mesma 
coleta. Se for o mesmo animal, mas momentos 
diferentes de coleta, a partida já é outra 
• Data: dia de manipulação. 
2) envase: 
O envase representa o processo de 
colocar o sêmen dentro da pipeta., 
e fazemos isso principalmente 
através da sucção com a boca. 
O conteúdo deve ser sugado até o 
fim, até que encoste na esponja da 
palheta., fora o contrário, o sêmen 
cairá dela. 
No congelamento, o líquido 
expande e endurece, e por isso 
devemos tirar um pouco do conteúdo da pipeta para que não 
rompa a palheta, o que pode ser feito manualmente com 
agulha e seringa ou com um “pente fino”. 
3) selar: 
Agora, devemos selar para 
tampar. Para isso fazemos uma 
pressão através de uma 
máquina ou com um pó 
chamado álcool poli-vilinico. Ao 
ser encostado na água, ele 
expande e sela. Outra opção são 
as esferas de metais que podem 
ser encaixados na ponta para 
que não saia. 
 
4) refrigerar: 
• Levamos as palhetas para uma geladeira a 5 graus 
por 20 minutos para que ele refrigere, visto que 
antes elas estavam a 37 graus. 
Nesse meio tempo; montamos uma caixa de isopor: 
• 30 litros 
• Altura de 3,5 a 6 cm de nitrogênio líquido dentro 
do isopor. 
• Altura de 3,5cm do nitrogênio até as palhetas 
Nessa caixa colocamos hastes para apoiar as palhetas na 
altura correta, de forma que fiquem apenas no vapor do 
nitrogênio, e não mergulhadas nele. (como se fosse uma 
grelha). 
 
 
• Deixamos 20 minutos nesse vapor 
• 20 minutos depois puxamos as hastes para que as 
palhetas caiam e entrem em contato com o 
nitrogênio, de forma que irão congelar. 
Se jogarmos de uma vez, ocorrerá um choque térmico nos 
espermatozoides e eles morrem. Por isso, a mudança de 
temperatura deve ser gradual. 
O botijão é dividido em canecos, e cada um tem um número 
onde são colocadas as palhetas. Sempre que formos 
manuseá-lo não devemos subir seu bucal para não perder 
temperatura no meio externo.