Aula 6 - SEQUENCIAMENTO DE DNA

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Sequenciamento de DNA
Como a sequência de bases de nucleotídeos (As, Ts, Cs, and Gs) de um 
pedaço de DNA é determinada
Prof. Dr. Adilson de Oliveira
Pontos Principais:
• Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da
sequência de nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de
DNA.
• No método Sanger de sequenciamento, o DNA alvo é copiado
muitas vezes, produzindo fragmentos de comprimentos
diferentes. Nucleotídeos “terminadores de cadeia” fluorescentes
marcam os finais dos fragmentos e permitem que a sequência
seja determinada.
• As técnicas de Sequenciamento de Última Geração são novas
abordagens feitas em grande escala que aumentam a velocidade
e diminuem os custos do sequenciamento.
A história do sequenciamento de DNA
• Os últimos 100 anos testemunharam uma verdadeira revolução no
entendimento de como a informação genética é armazenada, usada
e transmitida.
• Os trabalhos de Mendel, em 1850, foram capazes de demonstrar que
as características são transmitidas por hereditariedade ao longo das
gerações. Em 1944, o grupo do pesquisador Oswald Avery
demonstrou que a transferência de informações entre organismos
(no caso, bactérias) é viável e que ocorre pelo material genético, o
DNA.
Já em 1953, a estrutura de dupla-hélice do DNA foi desvendada por 
James Watson e Francis Crick. Isso ajudou no desenvolvimento da 
biologia molecular e da engenharia genética.
A história do sequenciamento de DNA
• Na década de 1970, Fred Sanger e Walter Gilbert desenvolveram 
as tecnologias de sequenciamento de DNA. Assim, tornaram 
possível que a informação genética começasse a ser desvendada.
• Até então, a manipulação de genes individuais ou de pequenos 
trechos do DNA parecia uma tarefa insuperável. O 
sequenciamento permitiu compreender melhor a estrutura e a 
função dos ácidos nucleicos. Esse foi o ponto de partida para hoje 
ser comum isolar e estudar um trecho de DNA.
In 1980, Paul Berg, Walter Gilbert and Frederick Sanger 
were awarded a Nobel Prize for their contributions 
concerning the determination of base sequences in DNA.
O legado de Frederick Sanger
• Frederick Sanger foi responsável por dois dos mais importantes 
avanços técnicos na área de genética. Primeiro, no início da 
década de 50, ele desenvolveu um método para determinar a 
sequência de aminoácidos de um polipeptídio e o fez funcionar no 
sequenciamento de aminoácidos da insulina.
• Este trabalho, finalizado em 1955, forneceu a primeira prova de 
que os aminoácidos em uma proteína estão presentes em uma 
sequência constante e geneticamente determinada. Isto deu aos 
biólogos moleculares a confiança em atacar outros problemas, tais 
como o código genético.
• Então, em 1977, Sanger aperfeiçoou um método rápido de
sequenciamento do DNA. Por essa razão, ficou conhecido como
método de sequenciamento de Sanger. Abriu assim a porta para a
análise da estrutura do gene e sua organização. Ambos os
avanços foram valiosos e reconhecidos com prêmios Nobel, em
1958 e 1980.
• O método desenvolvido por Sanger foi crucial para
desenvolvimento do Projeto internacional do Genoma Humano.
O que é sequenciamento?
Você deve ter ouvido falar que genomas estão sendo sequenciados.
Por exemplo, o genoma humano foi concluído em 2003, depois de
vários anos de esforços internacionais. Mas o que significa
sequenciar um genoma ou mesmo pequenos fragmentos de DNA?
Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da
sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de
DNA. Hoje em dia, com os materiais e equipamentos corretos,
sequenciar um pequeno fragmento de DNA é relativamente
simples.
• Sequenciar um genoma inteiro (todo o DNA de um organismo) 
permanece uma tarefa complexa. 
• Isso requer quebrar o DNA do genoma em pequenos fragmentos, 
sequenciar esses pedaços e montar as sequências em uma única e 
longa sequência "consenso". 
• Entretanto, graças a novos métodos que tem sido desenvolvidos 
nas duas últimas décadas, o sequenciamento genômico é agora 
muito mais rápido e mais barato do que era durante o Projeto 
Genoma Humano.
O Projeto Genoma Humano
• O Projeto Genoma teve como objetivo determinar a sequência de
todo o genoma humano. Esse esforço de pesquisa internacional,
custando mais de US $ 3 bilhões e levando 13 anos para ser
concluído. A primeira sequência completa foi determinada em
abril de 2003.
• O DNA sequenciado no Projeto Genoma Humano foi obtido a 
partir de 21 doadores, homens e mulheres, de diferentes grupos 
étnicos. O resultado possibilitou avaliar muitas informações sobre 
as diferenças entre os indivíduos de uma mesma espécie.
O Projeto Genoma Humano
• Esse mapeamento abriu diversas fronteiras e forneceu meios para
identificar mutações e doenças genéticas específicas. Pode determinar
quais trechos de DNA contêm genes e quais trechos carregam
instruções de regulação, ligando ou desligando os genes.
• Também abriu caminho para uma medicina mais personalizada,
permitindo aos cientistas examinar até que ponto a resposta de um
paciente a um medicamento é determinada pelo seu perfil genético.
• Essas conquistas exigiram o desenvolvimento e aprimoramento de
novas tecnologias, com a intenção de melhorar a eficácia dos cuidados
de saúde e promover a saúde humana. Claro que a medicina
totalmente personalizada ainda está longe de ser uma realidade para
todos, mas estes já são os primeiros passos.
Sequenciamento de Sanger: o método de 
terminação da cadeia
• Regiões de DNA com até 900 pares de base de comprimento são
rotineiramente sequenciados pelo chamado método Sanger de
sequenciamento ou método de terminação da cadeia.
• Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando
outros métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger ainda é
amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos
individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de
DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Ingredientes para o sequenciamento de 
Sanger
O método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma região
alvo de DNA. Os ingredientes são similares àqueles usados
para replicação de DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia
da polimerase (PCR), os quais fazem cópias de DNA in vitro. Eles
incluem:
• Uma enzima DNA polimerase
• Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que 
se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase
• Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• O DNA molde a ser sequenciado
Entretanto, uma reação de sequenciamento de Sanger contém um 
ingrediente único:
Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro 
nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com um 
corante de uma cor diferente
Dideoxinucleotídeos são similares aos
nucleotídeos comuns, ou deoxinucleotídeos, mas
com uma diferença chave: falta um grupo hidroxila
na posição 3' do carbono do anel de sacarose. Em
um nucleotídeo comum, o grupo 3' hidroxila atua
como um "gancho", permitindo que um novo
nucleotídeo seja adicionado à cadeia existente.
Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado
à cadeia, não há hidroxila disponível e nenhum
outro nucleotídeo pode ser adicionado. A cadeia
termina com o dideoxinucleotídeo, o qual é
marcado com um cor particular de corante
dependendo da base (A, T, C or G) que carrega.
Método Sanger de sequenciamento
• A amostra de DNA é combinada em um tubo com primer, DNA polimerase
e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os quatro
nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são
adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos
nucleotídeos comuns.
• A mistura é primeiro aquecida para a denaturação do DNA molde (separar
as fitas), então resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde
de fita simples. Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é
aumentada novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um
novo DNA a partir do primer.
• A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia
até que
aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal.
Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e
portanto a fita terminará em um dideoxinucleotídeo.
Este processo é repetido 
em um número de ciclos. 
Ou seja, o tubo irá conter 
fragmentos de diferentes 
comprimentos, 
terminando em cada uma 
das posições de 
nucleotídeos no DNA 
original. As extremidades 
dos fragmentos serão 
rotuladas com corantes 
que indicam o 
nucleotídeo final.
• Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados
através de um longo e fino tubo contanto uma matriz de gel
em um processo chamado de electroforese capilar em gel.
Pequenos fragmentos movem-se rapidamente através dos
poros do gel, enquanto longos fragmentos movem-se mais
devagar.
• Assim que cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final
do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o
corante anexado seja detectado.
• O menor fragmento (que termina apenas um nucleotídeo após o
primer) atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo
menor fragmento (terminando dois nucleotídeos após o primer), e
assim por diante.
• Portanto, a partir das cores dos corantes registradas uma após a
outra no detector, a sequência do pedaço original de DNA pode ser
construída com um nucleotídeo por vez. Os dados registrados pelo
detector consistem em uma série de picos em intensidade de
fluorescência, como mostrado no cromatograma acima. A sequência
de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma.
Usos e limitações
• O método Sanger de sequenciamento promove sequências de alta
qualidade para trechos relativamente longos (por volta de 900 pares
de base). É tipicamente usado para sequenciar peças individuais de
DNA, como plasmídeos bacterianos ou DNA copiado em PCR.
• Entretanto, o método Sanger de sequenciamento é caro e ineficiente
para projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma
inteiro ou metagenoma (o "genoma coletivo" de uma comunidade
microbiana). Para tarefas como essa, novas técnicas de
sequenciamento de larga escala são mais rápidas e menos caras.
Sequenciamento de Nova Geração: 
Next-Generation Sequence (NGS)
• Apesar de o método de Sanger ser utilizado até hoje, novas
técnicas têm sido desenvolvidas para o sequenciamento de DNA.
A mais recente é o sequenciamento de nova geração, também
chamada de sequenciamento de segunda geração ou ainda Next-
Generation Sequencing (NGS).
• Através do NGS é possível realizar o sequenciamento de um
genoma inteiro em questão de dias. A sua velocidade, capacidade
de gerar dados em larga escala e precisão, a um custo inferior aos
métodos tradicionais ganha, a cada dia, mais espaço.
Sequenciamento de Nova Geração: 
Next-Generation Sequence (NGS)
• O princípio básico das plataformas de NGS está em sequenciar
várias moléculas diferentes (ou vários fragmentos diferentes
provenientes do mesmo genoma) em paralelo.
• Logo, elas diferem fundamentalmente das metodologias de
Sanger, em que uma única sequência de DNA, oriunda de um
trecho específico, é obtida em cada reação. Isso é possível graças
à integração de ferramentas de nanotecnologia, robótica e
informática em aparelhos de alto desempenho.
A importância do sequenciamento
• Hoje é possível, portanto, determinar mais rapidamente uma sequência
completa de um genoma humano, diferente do período inicial do Projeto
Genoma. Os pesquisadores agora são capazes de comparar grandes
extensões de DNA (1 milhão de bases ou mais) de indivíduos diferentes,
com mais agilidade.
• Essas comparações podem gerar uma enorme quantidade de informações
sobre o papel da herança na suscetibilidade a doenças e em resposta a
influências ambientais. Abrem-se assim novas perspectivas para a medicina
baseada nas características genéticas de cada indivíduo, criando um vasto
potencial para diagnósticos e terapias.
• Da mesma forma, é possível determinar todo o conjunto de
microrganismos presente em um ambiente (microbioma) a partir do
sequenciamento de todo o DNA ali encontrado. Ou até mesmo comparar as
sequências do genoma de diferentes tipos de animais e organismos,
fornecendo insights sobre a biologia do desenvolvimento e da evolução.