Análise de Expressão Gênica - resumo

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Análise de Expressão Gênica 
 
A expressão gênica compreende desde a ativação do gene até que a proteína 
madura esteja em seu respectivo compartimento e esteja ativa para contribuir com a 
expressão do fenótipo da célula. Estudos com expressão gênica são direcionados para 
detectar e quantificar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) de um gene específico. A 
primeira técnica de avaliação de transcritos se iniciou com o Northern blot e 
posteriormente com hibridização in situ. 
Com os crescentes estudos de análise do transcriptoma e da expressão gênica e 
os avanços na metodologia utilizadas nessa área de pesquisa, vemos um acúmulo nas 
informações que permitem a compreensão de processos celulares e fisiológicos em 
diversas condições experimentais específicas. Por exemplo, a partir de análises de 
transcriptoma podemos avaliar quais genes estão sendo superexpressos em células 
cancerígenas em comparação com células normais. Além disso, podemos descobrir, 
utilizando técnicas que avaliem o transcriptoma, polimorfismos em transcritos e formas 
alternativas de splicing. 
De modo geral, a grande maioria das técnicas de análise de transcritos tem como 
primeira etapa a formação de um DNA complementar (cDNA) a partir do RNA extraído 
da célula. Essa etapa é realizada utilizando a enzima transcriptase reversa, sendo a técnica 
conhecida como RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). Essa 
técnica permite um aumento da quantidade de ácido nucleico que será utilizada em 
experimentos posteriores, permitindo sua detecção. 
 
PCR quantitativa ou PCR em tempo real (qPCR) 
Em 1984, Kary Mullis desenvolveu a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 
Essa técnica amplifica um segmento específico de DNA para obter centenas de milhões 
de cópias em poucas horas. Essa técnica foi utilizada para estudos qualitativos até que 
em, 1992, Higuchi e colaboradores desenvolveram a Reação em Cadeia da Polimerase 
quantitativa (qPCR), a qual emprega a técnica de PCR para estudos de expressão gênica. 
Para fazer isso, os pesquisadores usaram o mesmo material utilizado na PCR 
convencional: um par de primers específicos; trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs); 
um tampão de reacão; uma DNA polimerase termoestável; e eles adicionaram um 
fluorocromo que fluoresce quando excitado. Além disso, eles projetaram um sistema 
capaz de detectar em tempo real os produtos de PCR que iam sendo formados. O sistema 
utiliza uma câmera que detecta o aumento da fluorescência que ocorre quando o brometo 
de etídio é intercalado em novas cadeias de DNA formadas em cada ciclo. Portanto, na 
PCR em tempo real ou qPCR, os processos de amplificação e detecção ocorrem 
simultaneamente ao mesmo tempo. 
A reação de PCR consiste em uma série de mudanças cíclicas de temperatura. 
Cada ciclo é dividido em três etapas (Fig. 1): 
● Desnaturação: separação do DNA de cadeia dupla quando submetido a 95 °C. 
● Hibridização dos primers (anelamento): alinhamento dos primers ao DNA molde a uma 
temperatura em torno de 50 a 70 °C. 
● Elongação ou Polimerização: ligação dos dNTP correspondentes à cadeia de 
alongamento do DNA a uma temperatura em torno de 68-72 °C. 
Teoricamente, se a eficiência da reação for 100%, o número de moléculas de 
DNA duplicará com cada ciclo. A realidade é que a eficiência em condições ótimas será 
um pouco menor que 100%. 
 
Figura 1. Etapas do qPCR: desnaturação, anelamento dos primers e extensão 
(ou elongação). O fluoróforo está representado como uma molécula verde. 
 
 
Métodos de detecção 
A técnica de qPCR permite a quantificação do material estudado (DNA ou 
cDNA) usando fluoróforos. A fluorescência é medida em cada ciclo e é proporcional à 
quantidade do produto de PCR (quanto mais fluorescência era captada, mais DNA havia 
no final de cada ciclo de reação). 
Por um lado, os fluoróforos podem ser corantes fluorescentes que se ligam 
inespecificamente ao DNA de cadeia dupla e produzem uma quantidade fluorescente que 
se correlaciona com o número de cópias do DNA. Esses corantes são denominados 
intercalentes de DNA (Fig. 2). Neste grupo encontramos corantes como o SYBR Green. 
Por outro lado, podem ser utilizados fluorocromos ligados a sondas, que hibridizam 
especificamente com as cadeias de DNA amplificadas. Assim, a reação é mais específica 
e o sinal só é gerado quando a sonda hibridiza com sua região complementar. Neste grupo, 
encontramos sondas de hidrólise “TaqMan”, sondas FRET, sondas Beacon e sondas 
Scorpions. 
 
 
Figura 2. Fluorescente intercalante se ligando à dupla fita de DNA 
durante uma reação de qPCR. A detecção da fluorescênca é feita após 
o término da extensão da dupla fita (3ª etapa do ciclo). 
 
Intercalantes de DNA e curva de melting 
SYBR Green I é um composto orgânico com a fórmula química C32H37N4S. Está 
associado à molécula de DNA, interagindo com o sulco menor. É usado em coloração de 
DNA para análise por eletroforese de produtos de PCR, ou como um meio de visualização 
direta dos produtos de PCR em tempo real. 
A análise da curva de melting é necessária para detectar problemas de ligação 
não específica do SYBR Green ao DNA. A comparação das curvas de melting permite 
uma interpretação dos produtos amplificados em PCR. Diferentes produtos têm 
temperaturas diferentes porque a temperatura de melting depende do tamanho do 
amplicon, do conteúdo de GC e das estruturas secundárias e terciárias. No final da reação 
de PCR, um gradiente de 50 a 95 °C é feito para desnaturar o DNA de fita dupla. Quando 
o DNA de cadeia dupla se torna DNA de cadeia simples, a diminuição da fluorescência 
pode ser observada como picos, representados pela realização da segunda derivada da 
fluorescência. Se a reação não for específica, os produtos de PCR mostram picos de curva 
de melting diferentes (Fig. 3). Há mais de uma década, existem outros corantes 
fluorescentes, como LC Green, ResoLight, EvaGreen, Chromofy SYTO e BEBO. 
 
 
Figura 3. Análise de uma curva de melting. Nesse tipo de análise, após a reação de 
qPCR, um gradiente de temperatura é amplicado nas amostras. À medida que o 
DNA desnatura, a fluorescência diminui, a curva de melting pode ser visualizada 
no computador. A curva de cima (verde) mostra que o DNA amplificado é um só, 
sendo um mesmo produto final. A curva de baixo (vermelha) apresenta uma 
amplificação inespecífica (note os dois picos). Isso significa que há mais de um tipo 
de DNA amplificado. 
 
Sondas (TaqMan) 
A sonda TaqMan® pertence ao grupo de sondas de hidrólise e é baseada na 
atividade de exonuclease 5′-3′ da Taq polimerase. A sonda Taqman é uma sequência 
complementar a um produto de PCR que não faz parte dos primers. A sonda é marcada 
com um fluoróforo que se liga covalentemente a sua extremidade de 5′ (chamada de 
“doador”) e com um quelante ligado covalentemente a sua extremidade 3′ (também 
chamada de “aceptor”) cuja função é quelar a fluorescência emitida pelo fluoróforo 
quando é excitado pela luz. A atividade de exonuclease 5′ degrada a sonda e libera o 
fluoróforo que emitirá fluorescência quando não estiver próximo do quelante (Fig. 4). O 
fluoróforo liberado é proporcional à quantidade de DNA amplificado na PCR. A sonda 
deve estar próxima de um primer e o tamanho do amplicon não deve ser maior que 200 
pares de bases. Outra desvantagem é que essas sondas não permitem a análise da curva 
de melting, porque a hidrólise da sonda impede sua reutilização. 
 
 
Figura 4. Detecção de cópias de DNA durante a qPCR utilizando a sonda 
TaqMan®. A sonda apresenta um fluoróforo (F) e um quelante (Q) 
ligados em cada extremidade. Quando a Taq polimerase quebra a sonda 
durante a fase de extensão, a fluoróforo se distancia do quelante e emite 
fluorescência, que é captada pelo leitor do termociclador. 
 
Termos utilizados na qPCR 
Todos os sistemas quantificam e registram similarmente o sinal fluorescente em 
cada ciclo da PCR. A cinética da reação(a curva) mostra uma representação formando 
uma forma sigmóide. A representação gráfica (Fig. 5) é definida pelo ciclo de linha de 
base (background baseline), limiar de detecção (threshold) e ciclo do limiar de detecção 
(cycle threshold). Todos esses dados são analisados pelo programa de computador. 
● Background: Fluorescência não específica da reação. O algoritmo matemático remove-
o. 
● Linha de base (baseline): nível de ruído nos ciclos iniciais de PCR, onde não é detectado 
um aumento na fluorescência do produto de PCR. Determina a fluorescência basal (não 
há positividade). 
● Limiar de detecção (Threshold): o valor do limiar de detecção é definido logo acima do 
nível da linha de base, onde a amplificação exponencial começa. Quando a curva de 
fluorescência ultrapassa o limiar de detecção, consideramos que houve positividade. O 
limiar de detecção pode ser determinado automaticamente (pelo programa) ou 
manualmente. 
● Ciclo do limiar de detecção (Cycle threshold, Ct): o ciclo no qual a fluorescência 
ultrapassa o limiar de detecção. Este ciclo é utilizado para quantificação relativa da 
expressão gênica. 
 
 
Figura 5. Ciclo de uma qPCR com os termos base representados. O 
threshold está representado pela linha “baseline”. 
 
Fases da qPCR 
A reação qPCR envolve três fases que podem ser representadas como uma curva 
sigmoidal (Fig. 6). As três fases são as seguintes: 
● Fase exponencial: a quantidade de produto é pequena, o produto de PCR é gerado 
exponencialmente porque a enzima e os reagentes não são limitados, de modo que a 
reação pode atingir a máxima eficiência. Esse crescimento exponencial é difícil de 
detectar porque a quantidade de produto é insuficiente. A quantidade de produto neste 
estágio é proporcional à quantidade da amostra inicial. 
● Fase linear: a quantidade de produto aumenta linearmente porque a quantidade de 
enzima e reagentes começa a ser limitada, de modo que a eficiência da reação diminui. 
● Fase de platô: a reação diminui até que os dNTPs e os primers necessários para a nova 
síntese sejam esgotados. 
O ciclo no qual a fluorescência começa a exceder o nível de fundo é chamado de 
ciclo do limiar de detecção (Ct) e é o início da fase logarítmica. Portanto, o Ct é 
inversamente correlacionado com a quantidade de amostra: quanto menor o Ct, maior a 
quantidade de cDNA. 
 
 
Figura 6. Fases da qPCR. 
 
Quantificação 
Para quantificar a expressão do gene em estudo, existem dois métodos, 
chamados de quantificação absoluta e quantificação relativa. No primeiro caso, a 
quantidade de expressão absoluta é expressa como o número de cópias obtidas. No 
segundo, a quantificação é baseada em um calibrador, cujo valor é referência para todos 
os outros, atribuindo a ele um valor de 1. 
Para realizar a quantificação absoluta é necessário conhecer o número de 
cópias do gene alvo em uma amostra padrão. Geralmente, esta amostra padrão é um DNA 
de plasmídeo ou DNA complementar (cDNA) cujas concentrações são medidas por um 
espectrofotômetro. No ensaio, deverão ser preparadas diluições em série da amostra 
padrão em que o gene alvo será amplificado. 
O computador registra os ciclos de limiar de detecção (Ct) para cada amostra. 
As diluições de uma amostra padrão mostram uma curva padrão que afeta o número de 
cópias por interpolação do Ct e permite quantificar as amostras. 
Existem três métodos para quantificação relativa; o mais utilizado é o método 
2-ΔΔCT. Este método assume que o procedimento dobra o conteúdo de DNA em cada 
ciclo, que a eficiência da reação é 100%, e que um gene de referência é expresso em um 
nível constante entre todas as amostras. Este gene de referência é um gene constitutivo 
(gene housekeeping) que é usado como um controle endógeno para corrigir a 
variabilidade intra e inter-ensaio. 
A expressão do gene de referência é imutável nas diferentes amostras do ensaio 
pois é um gene cuja função está relacionada à manutenção da célula, portanto, também é 
chamado de gene constitutivo. O resultado da análise relativa é dado em ordem de 
grandeza comparado com o gene controle (2x mais expresso, 5x mais expresso, 2x menos 
expresso...). 
 
Microarray (Microarranjo) 
A técnica de Microarrays baseia-se na complementaridade entre as cadeias de 
ácidos nucleicos que permite a detecção de sequências específicas, a qual é chamada de 
hibridização. 
O microarranjo, também conhecido como chip de DNA ou biochip, é um suporte 
sólido de vidro, plástico ou nylon que é unido a oligonucleotídeos cujas sequências 
correspondem a todas as regiões do genoma que se quer estudar. Os fabricantes usaram a 
mesma tecnologia usada nos chips semicondutores, mas colocando verticalmente milhões 
de fitas de DNA no suporte. Cada oligonucleotídeo é colocado em uma área específica 
chamada “célula de sonda” (spots), onde bilhões de cópias do oligucleotídeo são 
encontradas. Estes oligonucleotídeos são sintetizados antes da ligação ao suporte ou no 
suporte. 
Há doois tipos de microarrays: microarranjos de expressão, onde sequências 
específicas de RNA (cDNA) são detectadas e microarranjo de genotipagem para 
detecção de sequências específicas de DNA. Ao comparar os resultados de ambas os 
arranjos, pôde-se estabelecer a relação de polimorfismos com a expressão gênica, o que, 
entre outras coisas, poderia explicar a diferente resposta ao tratamento observado entre 
pacientes com diferente genética. 
A metodologia desta técnica inclui os seguintes passos (Fig. 6): 
● Extração e preparação de RNA: o RNA é extraído das células, tentando obter RNA com 
a mais alta pureza e qualidade possível, evitando assim uma importante fonte de 
variabilidade. 
● Transcrição reversa: para converter mRNA em cDNA. 
● Marcando as sondas: o cDNA é fragmentado e marcado com biotina. Depois, a 
molécula fluorescente que se liga à biotina é adicionada. Geralmente as moléculas são 
Cye3 (fluorescência verde) e Cye5 (vermelho). Cada DNA (amostra e controle) é 
marcado com um fluoróforo diferente, 
● Hibridização das sondas: o cDNA com fluoróforo é colocado sobre a lâmina contendo 
as sondas. O tempo necessário para a hibridação completa é diretamente proporcional à 
concentração da amostra. No final deste processo, o microarranjo hibridizado é lavado 
para remover cadeias não ligadas. 
● Varredura do microarray: a detecção de luz fluorescente indica que a hibridização 
ocorreu em um ponto específico para uma sequência específica. A leitura é realizada 
por um laser e a fluorescência é registrada por varredura. A intensidade da fluorescência 
é proporcional à quantidade de sonda ligada a cada amostra. 
As imagens formadas são analisadas em software específico. A intensidade de 
fluorescência de cada spot é quantificado. Softwares de aquisição precisam identificara a 
distribuição, formato e intensidade dos spots, distância entre eles, resolução da imagem e 
background. 
 
 
Figura 6. Passos para a realização de um teste utilizando microarranjo. As lâminas 
contendo as sondas é adquirida de um fornecedor. Duas amostras são analisadas (por 
exemplo: células normais e células cancerígenas). O mRNA é extraído e o cDNA 
produzido a partir de RT-PCR é marcado com fluoróforos (Cye 3 ou Cye 5). As amostras 
são depositadas sobre a superfície sólida contendo as sondas. Após lavagem, apenas o 
cDNA que hibridizou nas sondas da lâmina irão permanecer. Um laser é incidido e 
fluorescência emitida é captada e fotografada. Um software de análise é posteriormente 
utilizado para determinar a intensidade da fluorescência de cada fluoróforo. 
 
Expressed Sequence Tag (EST) 
Os marcadores de sequência expressa (ESTs) são leituras de sequência curta, 
tipicamente dentro da faixa de 100 a 700 pb, obtidas a partir de clones de cDNA 
selecionados aleatoriamente. O conceito foi introduzido pela primeira vez como uma 
abordagem mais econômica para a rápida descoberta e caracterização de genes expressos.As ESTs são frequentemente geradas por sequenciação de passo único de clones de cDNA 
de uma (single-end) ou ambas as extremidades (paired-end), geralmente cobrindo apenas 
uma parte da sequência do transcrito, e são relativamente propensas a erros. Apesar desta 
última característica, o sequenciamento de ESTs representa uma metodologia mainstream 
(principal, muito utilizada) para o estudo de genes expressos. 
Mesmo hoje em dia, quando as sequências do genoma completo estão 
disponíveis para muitos organismos, as ESTs ainda desempenham um papel importante 
na identificação de genes, mapeamento de transcritos e descrição da atividade 
transcricional de um tipo de tecido/célula. Além disso, as ESTs podem representar um 
corpo de evidências muito importante para a predição de genes e um recurso abundante 
de marcadores moleculares para o mapeamento físico. Outra aplicação prevista de ESTs 
é a quantificação da expressão de genes, uma vez que quanto mais uma sequência é lida, 
mais expresso é aquele gene. 
Para analisar ESTs, se maneira geral, as seguintes etapas não realizadas (Fig. 7): 
● Extração e preparação de RNA: o RNA é extraído das células, tentando obter RNA com 
a mais alta pureza e qualidade possível, evitando assim uma importante fonte de 
variabilidade. 
● Transcrição reversa: para converter mRNA em cDNA. 
● Clonagem: os fragmentos de cDNA obtidos são inseridos em um vetor para realização 
de clonagem e obtenção de uma biblioteca de cDNA. 
● Sequenciamento das extremidades: Uma (single-end) ou ambas (paired-end) as 
extremidades do cDNA clonado não sequenciados. O Sequenciamento é feito apenas 
uma vez para cada livro da biblioteca. 
● Depósito em bancos de dados: os dados obtidos são processados em computador e 
depositados em bancos de dados específicos para EST. 
 
 
Figura 7. Passos realizados na obtenção de ESTs. 
 
O banco de dados EST do Genbank (dbEST) é um repositório disponível ao 
público, útil para estudos de descoberta de genes e expressão comparativa de genes. 
Constitui a divisão EST do Genbank e corresponde à maior fração (48%) das inscrições 
(fonte: página da Internet do NCBI http://www.nlm.nih.gov/7.4). Em outubro de 2006, o 
dbEST (release 100606) compreendia mais de 38 milhões de inscrições de mais de 1200 
organismos, embora cerca de metade das entradas provenham de apenas oito organismos. 
Atualmente, o Genbank conta com mais de 74,2 milhões de ESTs no seu banco de dados 
(Fig. 8). 
 
 
Figura 8. Exemplo de EST obtido ano banco de dados do Genbank. Note, na segunda 
linha da sequência fasta a região complementar à cauda poli-A do mRNA. 
 
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) 
A análise serial da expressão gênica (SAGE) é uma poderosa abordagem de 
análise ampla de expressão genômica utilizada para a caracterização de transcriptomas. 
O método baseia-se em três princípios: (i) tags de sequência curta (10–27 pb) obtidos de 
uma posição definida do cDNA são suficientes para identificar transcritos de forma 
exclusiva; (ii) os marcadores podem ser concatemerizados para formar fragmentos de 
DNA longos (concatêmeros), que podem ser clonados e sequenciados para aumentar a 
eficiência da análise de transcrito baseada em sequências; e (iii) o nível de expressão de 
cada transcrito é quantificado pelo número de vezes que uma tag particular é observada. 
A geração de uma biblioteca SAGE envolve a obtenção de tags de sequência 
curta a partir de locais específicos de transcritos utilizando uma combinação de enzimas 
de restrição (ancoragem e marcação). Essas tags podem ser ligadas, clonadas, 
sequenciadas e exclusivamente mapeadas para transcritos. A abundância de uma tag em 
uma biblioteca SAGE (isto é, a coleção de todas as tags de uma amostra) reflete o número 
real de cópias de transcritos dentro da célula. 
O SAGE tem sido uma abordagem valiosa para a identificação de marcadores 
diagnósticos e prognósticos, bem como para alvos terapêuticos no câncer. Tem sido usado 
para caracterizar transcriptomas após a ativação de oncogene (por exemplo, c-MYC36 e 
ERBB2) ou estimulação hormonal (estrogênio), para o perfil de vários tipos de câncer 
(incluindo leucemia mielóide aguda, melanoma, carcinoma gástrico, cólon e próstata), 
para detectar alterações na expressão gênica durante a progressão do câncer de mama, 
para caracterizar alterações no microambiente tumoral e definir as bases moleculares da 
quimiorresistência. 
Os passos gerais para realizar a técnica de SAGE são as seguintes (Fig. 9): 
● Extração e preparação de RNA: o RNA é extraído das células, tentando obter RNA com 
a mais alta pureza e qualidade possível, evitando assim uma importante fonte de 
variabilidade. 
● Transcrição reversa: para converter mRNA em cDNA. 
● Clivagem dos frafmentos: os cDNA são ancorados em uma superfície sólida e uma 
enzima de restrição que corta todas as fitas em um mesmo tamanho é utilizada para 
formação das tags (pequenos pedaços de DNA). 
● Formação dos concatêmeros: As tags são unidas com a ajuda de ligases para formar 
uma fita grande de DNA, o concatêmero. 
● Clonagem: os concatêmeros são inseridos em um vetor e clonados. 
● Sequenciamento: os concatêmeros são então sequenciados. 
● Processamento dos dados: os resutados de sequenciamento são processados em um 
software para análise de concatêmeros. O programa separará as sequências das tags, e 
o padrão de expressão de cada tag poderá ser analisada e comparada com outras 
amostras. 
 
 
 
 
 
Figura 9. Passos realizados na SAGE. 
Após isolamento de mRNA e 
realização de RT-PCR, as fitas de 
cDNA são cortadas utilizando uma 
enzima de restrição em pedaços 
pequenos (tags). As tags são unidas em 
um concatêmero, sendo este último 
clonado. O concatêmero é sequenciado 
e o resultado do sequenciamento 
inserido em um programa de 
computador que avaliará quantas vezes 
a mesma tag apareceu durante o 
sequenciamento. Quanto mais a mesma 
tag aparece, mais o gene a qual aquela 
sequência pertence está sendo 
expresso. 
Referências 
 
Gruber, A. (2007) Expressed sequence tags. In: Paul Dear. (ed) Bioinformatics: 
Methods Express. Bloxham Mill, Oxfordshire, UK: Scion Publishing Ltd. 
Hu, M., & Polyak, K. (2006). Serial analysis of gene expression. Nature Protocols, 
1(4), 1743–1760. 
San Segundo-Val I., Sanz-Lozano C.S. (2016) Introduction to the Gene Expression 
Analysis. In: Isidoro García M. (eds) Molecular Genetics of Asthma. Methods in 
Molecular Biology, vol 1434. Humana Press, New York, NY. 
 
 
http://lattes.cnpq.br/8644261025719801
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