CRISPR-CAS9

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CRISPR-CAS9 
 
O locus CRISPR-CAS9 (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e 
Regularmente Espaçadas) é um dos mecanismos de defesa bacteriano e de arqueas contra 
invasões de bacteriófagos, sendo capaz de memorizar o material genético do invasor, 
evitando novas invasões. Esse mecanismo foi descoberto em bactérias Escherichia coli, 
quando foi observado a presença de uma curta sequência de DNA bacteriano 
acompanhada de fragmentos de DNA semelhantes ao dos vírus bacteriófagos. 
Um vírus invade a célula da bactéria, introduzindo o seu material genético e dominando 
o aparato enzimático bacteriano, dessa forma a bactéria produzirá um novo material 
genético e proteínas virais para formação de novas cápsulas virais. Como defesa, a 
bactéria irá liberar proteínas CAS9 que são endonucleases de restrição, responsáveis 
pela clivagem do DNA, que irá fragmentar o material genético do invasor, armazenando 
essas pequenas sequências de DNA viral na estrutura denominada CRISPR. A partir 
desse DNA viral fragmentado, a proteína CAS9 atua novamente produzindo uma 
sequência de RNA, ou CRISPR RNA, responsável por ser um complexo guia, que é 
capaz de parear com as bases de uma sequência-alvo. 
Em 2012 Jennifer Doudna (bióloga molecular e bioquímica) e Emmanuele Charpentier 
(microbiologista) inventaram uma tecnologia de edição genômica, publicado no artigo 
“Uma Endonuclease de DNA Guiada por RNA duplo Programável na Imunidade 
Bacteriana Adaptativa”, que possibilita a programação do CRISPR e da enzima CAS9 
para cortar precisamente uma molécula de DNA em qualquer trecho. É uma ferramenta 
precisa, com alta especificidade, acessível e fácil de usar. 
Nesse sentido, a técnica CRISPR-CAS9 é amplamente utilizada no campo da medicina, 
principalmente no tratamento de doenças que acometem o material genético de 
indivíduos, como a fibrose cística. 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE - UNICENTRO 
Centro de Desenvolvimento Tecnológico de Guarapuava - CEDETEG 
Setor de Ciências Agrárias e Ambientais - SEAA/G 
Departamento de Biologia - DEBIO/G 
Curso de Ciências Biológicas – Disciplina de Bioquímica Metabólica 
Profa. Welligton Luciano Braguini 
Acadêmico(a): Luana Rickli, Luana Graebin, Maria Clara Itoh Nascimento 
 
A fibrose cística é uma doença hereditária causada por uma mutação no gene CFTR, 
responsável pela deficiência no transporte de íons através das membranas das células 
com redução na quantidade de água da secreção dos brônquios. O que resulta numa 
maior aderência da secreção às paredes brônquicas, comprometendo a limpeza desses 
canais, e consequentemente facilitando a ocorrência de infecções pulmonares. 
Essa mutação pode ser corrigida através da edição da molécula de DNA no gene CFTR, 
local da mutação. Para que essa correção seja possível a edição genética precisa entrar 
no núcleo das células da pessoa acometida pela doença, ação desafiadora que pode ser 
realizada através da técnica CRISPR. Uma técnica de edição de genes muito versátil e 
acessível comparada a outras disponíveis no mercado. 
O mecanismo de edição do CRISPR para corrigir a mutação que causa fibrose cística, 
inclui um guia capaz de localizar a sequência de DNA com mutação no CFTR, um 
segmento da molécula de DNA sem a mutação e “tesouras” capazes de quebrar o DNA 
onde a mutação se localiza. 
Ao serem inseridas na célula essas ferramentas atingem a sequência de DNA com a 
mutação, onde ocorre a clivagem da molécula, que dispara os mecanismos de reparo do 
DNA, que usará o modelo da CRISPR - CAS9 para corrigir a molécula de DNA. Esse 
tipo de técnica pode reparar uma mutação de cada vez, ou grupos de mutações 
semelhantes, dependendo de como as mutações se organizam no DNA. 
Aplicação do CRISPR/Cas9 no diagnóstico de câncer 
É sabido que o diagnóstico e o tratamento precoce do câncer podem aumentar a 
expectativa e qualidade de vida dos pacientes. Várias técnicas são utilizadas atualmente 
para essa detecção, porém, as mesmas carecem de melhorias em termos de sensibilidade, 
especificidade e velocidade. Portanto, identificar os genes sensíveis por meio do 
diagnóstico genético, é fundamental para a prevenção do câncer. 
Para superar esses problemas, foi estabelecido um sistema de diagnóstico com base no 
CRISPR, chamado SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter 
UnLOCKing). Este sistema consiste na RNase do Cas13a, guiada por RNA (induz a trans-
clivagem robusta de DNA de fita simples não específica (ssDNA) como efeito colateral) 
e um sinal repórter (liberado após a clivagem do RNA), que demonstrou alta sensibilidade 
na detecção de mutações de BRAF V600E e EGFR L858R em células de mamíferos. 
Outro sistema, extremamente similar, denominado DETECTR (DNA endonuclease-
targeted CRISPR trans reporter), consiste em Cas12a e amplificação de polimerase 
recombinase (RPA) e é usado como uma ferramenta de detecção para rastrear infecções 
virais em câncer e para amplificar microamostras. O sistema é rápido e, ainda por cima, 
de baixo custo para detectar tipos de HPV de alto risco, como HPV16 e HPV18, em 
amostras infectadas com muitos tipos diferentes de HPV. 
Aplicação de ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9 para diagnóstico e 
terapia de câncer 
A edição do gene CRISPR já transformou a maneira de como os cientistas realizam suas 
pesquisas, permitindo uma maior gama de aplicações em vários campos. Ademais, a 
tecnologia também apresenta um grande potencial como tratamento para doenças 
humanas. Teoricamente, o CRISPR permitiria editar qualquer mutação genética à 
vontade, para curar qualquer doença de origem genética. Entretanto, na prática, o 
CRISPR ainda está em estágios iniciais de seu desenvolvimento terapêutico. 
A China é, atualmente, a líder no quesito dos primeiros testes clínicos usando CRISPR-
Cas9 como tratamento de câncer. Um desses estudos, buscava utilizar-se do CRISPR 
para modificar células T imunes, extraídas do paciente. A tecnologia de edição de genes 
é usada para remover o gene que codifica a proteína chamada PD-1, encontrada na 
superfície das células do sistema imunológico, alvo de alguns medicamentos contra o 
câncer, como os inibidores de checkpoint. Isso ocorre porque algumas células tumorais 
são capazes de ligar-se à proteína PD-1 para bloquear a resposta imune contra o câncer. 
Esse estudo chines testou a abordagem em 12 pacientes com câncer de pulmão de células 
não pequenas no Hospital da China Ocidental. Os resultados, publicados em abril de 
2020, sugeriram que a abordagem era viável e segura. No entanto, uma publicação 
posterior apontou que o estudo na verdade revelou algumas das limitações da tecnologia, 
incluindo sobre a eficiência variável no processo de edição do genoma. Alguns 
especialistas recomendaram a revisão da segurança a longo prazo, outros sugeriram o uso 
de abordagens de edição de genes mais precisas, como edição de base. 
Nos Estados Unidos, um teste de fase I, conduzido pela Universidade da Pensilvânia, 
testou a segurança de uma abordagem semelhante. Os pesquisadores usaram o CRISPR 
para remover três genes, que ajudam as células cancerosas a escapar do sistema 
imunológico, eles então continuaram adicionando outro gene para ajudar as células 
imunológicas a reconhecer tumores. Os resultados revelaram um tratamento seguro para 
pacientes em formas avançadas de câncer. 
Paralelamente, a empresa CRISPR Therapeutics está realizando estudos de fase I global, 
que pretende recrutar mais de 130 pacientes com câncer no sangue, para testes de uma 
terapia com células CAR-T, realizada com a tecnologia CRISPR. 
Considerando que o CRISPR-Cas9 é um desenvolvimento relativamente novo no mundo 
da biologia, as pesquisas até o momento são consideradas como preliminares e os 
exemplos citados são apenas as primeiras tentativas da utilização da tecnologia CRISPR 
como terapia. À medida que avançam os estudos, espera-se que cada vez mais indicaçõessejam adicionadas à lista. Os dos maiores desafios para a transformação de pesquisa em 
cura real estão nas muitas incógnitas a respeito dos riscos potenciais da terapia CRISPR 
e também nas questões éticas que englobam as alterações genômicas. 
Diversos cientistas preocupam-se com os possíveis efeitos fora do alvo, bem como as 
reações imunológicas à ferramenta de edição de genes. Entretanto, à medida que a 
pesquisa avança, pode-se propor e testar uma variada gama de abordagens para ajustar e 
melhorar o CRISPR, com a finalidade de aumentar sua eficácia e segurança. 
 
REFERÊNCIAS 
A revolucionária tecnologia CRISPR permite a edição de genes defeituosos. 
Disponível em: <https://www.uai.com.br/app/noticia/saude/colunistas/andre-
murad/2021/11/01/noticias-saude,280653/a-revolucionaria-tecnologia-crispr-permite-a-
edicao-de-genes-defeituosos.shtml > Acesso em: 20/01/2022 
CRISPR-CAS9. Disponível em: 
<https://www.microbiologia.ufrj.br/portal/index.php/en/graduacao-2/informe-da-
graduacao/995-crispr-cas9> Acesso em: 20/01/2022 
Enzimas de restrição. Disponível em: 
<https://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/FundBiolMolec/3ModRestrClonDNA.pdf 
https://www.cff.org/research-clinical-trials/gene-editing-cystic-fibrosis> Acesso em: 
20/01/2022 
Fibrose Cística. Disponível em: 
<http://www.ghente.org/ciencia/genetica/fibrose_cistica2.htm#:~:text=A%20fibrose%2
0c%C3%ADstica%20ocorre%20a,%C3%A1gua%20da%20secre%C3%A7%C3%A3o
%20dos%20br%C3%B4nquios.> Acesso em: 20/01/2022 
How CRISPR lets us edit our DNA | Jennifer Doudna TED talk. Disponível em: < 
https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc > Acesso em: 20/01/2022 
J. Martin; C. Krzysztof; F. Ines; H. H. Michael; D. Jennifer; C. Emmanuelle. A 
Programmable Dual-RNA–guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. 
Science, 337(6096), 816-821. 
 
https://www.uai.com.br/app/noticia/saude/colunistas/andre-murad/2021/11/01/noticias-saude,280653/a-revolucionaria-tecnologia-crispr-permite-a-edicao-de-genes-defeituosos.shtml
https://www.uai.com.br/app/noticia/saude/colunistas/andre-murad/2021/11/01/noticias-saude,280653/a-revolucionaria-tecnologia-crispr-permite-a-edicao-de-genes-defeituosos.shtml
https://www.uai.com.br/app/noticia/saude/colunistas/andre-murad/2021/11/01/noticias-saude,280653/a-revolucionaria-tecnologia-crispr-permite-a-edicao-de-genes-defeituosos.shtml
https://www.microbiologia.ufrj.br/portal/index.php/en/graduacao-2/informe-da-graduacao/995-crispr-cas9
https://www.microbiologia.ufrj.br/portal/index.php/en/graduacao-2/informe-da-graduacao/995-crispr-cas9
https://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/FundBiolMolec/3ModRestrClonDNA.pdf
https://www.cff.org/research-clinical-trials/gene-editing-cystic-fibrosis
http://www.ghente.org/ciencia/genetica/fibrose_cistica2.htm#:~:text=A%20fibrose%20c%C3%ADstica%20ocorre%20a,%C3%A1gua%20da%20secre%C3%A7%C3%A3o%20dos%20br%C3%B4nquios
http://www.ghente.org/ciencia/genetica/fibrose_cistica2.htm#:~:text=A%20fibrose%20c%C3%ADstica%20ocorre%20a,%C3%A1gua%20da%20secre%C3%A7%C3%A3o%20dos%20br%C3%B4nquios
http://www.ghente.org/ciencia/genetica/fibrose_cistica2.htm#:~:text=A%20fibrose%20c%C3%ADstica%20ocorre%20a,%C3%A1gua%20da%20secre%C3%A7%C3%A3o%20dos%20br%C3%B4nquios
https://www.youtube.com/watch?v=TdBAHexVYzc