Testes Sorológicos - Reagentes não marcados

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ANTICORPOS
• Os anticorpos podem se apresentar em duas formas:
- secretada: no sangue e em outros fluidos- secretada: no sangue e em outros fluidos
extracelulares;
- ligada: ligada somente na membrana celular de
linfócitos B que sintetizam anticorpos.
ESTRUTURA DOS ANTICORPOS
• Também conhecidos como imunoglobulinas (Ig);
• Os Ac possuem as mesmas características estruturais
básicas, mas apresentam uma grande variedade nasbásicas, mas apresentam uma grande variedade nas
regiões que ligam os antígenos;
• O que confere a capacidade de ligação a um número
enorme de antígenos estruturalmente diversos;
Níveis Séricos Normais e Meia-Vida das 
Imunoglobulinas
Classe (isótipo) Concentração Sérica 
(mg/dL)
Meia-Vida (dias)
IgM 150 5
IgG 1350 23IgG 1350 23
IgA 350 6
IgE <0,05 2
IgD traços 3
RELAÇÃO ENTRE ESTRUTURA E 
FUNÇÃO DOS ANTICORPOS
• Existem muitas características dos anticorpos que são
críticas no reconhecimento de antígenos:
- Especificidade;- Especificidade;
- Diversidade;
- Afinidade e Avidez.
TESTES SOROLÓGICOS
REAGENTES NÃO MARCADOS
Professora: Natália Malavasi Vallejo
INTRODUÇÃO
• Testes empregados para detectar anticorpos e antígenos;
• Avaliação quantitativa e qualitativa das respostas
imunológicas do hospedeiro;
• Antígenos molecularmente clonados � precisão da detecção• Antígenos molecularmente clonados � precisão da detecção
de anticorpos;
• Formação do complexo antígeno-anticorpo �
imunocomplexo
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
• Esta ligação é a base de grande parte dos testes
imunológicos;
• De forma simples: a formação do imunoclomplexo é• De forma simples: a formação do imunoclomplexo é
monitorada pela ocorrência de precipitação do complexo ou
pela presença de um marcador.
• Os antígenos possuem estruturas químicas que favorecem a
complementaridade com o anticorpo, através de ligações não-
covalentes;
• São reversíveis e possuem afinidades diferentes com diversas
substâncias;
• Como um anticorpo pode se relacionar com antígenos com
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
• Como um anticorpo pode se relacionar com antígenos com
afinidades diversas, ele pode ligar-se com um que não seja seu
antígeno de melhor complementaridade através de ligações
mais fracas com regiões semelhantes, mas não idênticas,
àquele que o induziu;
• Essa ligação é chamada de reação cruzada (glicoproteína das
hemácias x bactérias intestinais, vírus e bactérias possuem
determinantes antigênicos semelhantes da célula hospedeira).
• A interação entre um anticorpo e seu antígeno pode ser rompida
por altas concentrações de sal, pH extremo, detergentes e,
algumas vezes, por competição com altas concentrações do
próprio epítopo puro. A ligação portanto é uma interação não
covalente reversível.
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
• Para ocorrer a eficiente ligação Ag-Ac é preciso que eles
estejam em concentrações ótimas:
- zona de equivalência: precipitação máxima (concentrações
de Ag e Ac são equivalentes);
LIGAÇÃO DE ANTÍGENO E ANTICORPO 
NO IMUNODIAGNÓSTICO
- zona de excesso de Ag ou Ac: formam quantidades
decrescente de precipitado ou precipitados pequenos
(podendo resultar em uma interpretação incorreta dos testes);
- fenômeno pró-zona: formação subótima de
imunocomplexos quando os Ac ou Ag estão presentes em
excesso (podendo resultar em uma interpretação incorreta
dos testes).
TESTES SOROLÓGICOS
• Reagentes não-marcados:
- Reação de precipitação:
- Imunodifusão simples;
- Imunodifusão dupla;
- Imunoeletroforese;- Imunoeletroforese;
- Imunofixação;
- Imunocromatografia.
- Reação de aglutinação:
- Direta: Detecção de determinantes antigênicos ligados a
superfície de células;
- Indireta: Detecção de partículas inerentes que se ligam a
superfície de células.
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO
• Interação entre Ac e Ag – solúvel;
• Depende da concentração relativa de Antígeno e Anticorpo;
• A reação pode ser afetada pelo número de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag � Valência.que cada Ac possui para seu Ag � Valência.
PRECIPITADOPRECIPITADO
IMUNODIFUSÃO
• Difusão de Ag ou Ac solúveis em meio ágar (semi sólido),
com Ag ou Ac incorporado a agarose;
- Simples: incorpora-se o soro (Ac) no ágar e em orifícios é
aplicado o antígeno � complexo (precipitação e formaçãoaplicado o antígeno � complexo (precipitação e formação
do halo);
- Dupla: ambos solúveis � complexo (encontro do Ag com o
Ac);
IMUNODIFUSÃO SIMPLES
IMUNODIFUSÃO DUPLA
• Teste utilizado para detecção da presença de Ac ou Ag com
mais de uma amostra teste (Ac ou Ag).
IMUNOELETROFORESE
• Combina a eletroforese em gel, seguida da imunodifusão e
precipitação das proteínas;
• Duas etapas:
1ª - Separação eletroforética das proteínas;
2ª - Imunodifusão de cada componente.
• Formação de uma linha ou arco de precipitação na região de• Formação de uma linha ou arco de precipitação na região de
equivalência;
• Caracterização de uma substância é feita a partir:
- propriedades eletroforéticas (mobilidades diferentes devido a
cargas elétricas diferentes);
- coeficientes de difusão;
- propriedades imunológicas (especificidade).
IMUNOELETROFORESE
A imunoeletroforese pode ser 
utilizada para detecção de 
proteína-M (monoclonal). É 
tecnicamente mais fácil e de 
menor custo quando comparada 
à técnica de imunofixação, no 
entanto não é tão sensível
IMUNOFIXAÇÃO
• Realizada quando um pico ou banda é encontrada na
eletroforese de proteínas séricas ou quando há suspeita de
gamopatia monoclonal (condição patológica);
• Combinação da eletroforese e a imunoprecipitação;
• Procedimento com dois estágios:
- a amostra é aplicada em seis posições diferentes do gel de- a amostra é aplicada em seis posições diferentes do gel de
agarose e as proteínas são separadas por eletroforese de
acordo com a carga;
- os soros mono específicos para IgG, IgA, IgM, cadeia kappa e
cadeia lambda impregnados numa fita de papel ou acetato de
celulose são colocados individualmente sobre cada posição,
seguidos da aplicação de solução fixadora de proteínas;
• Identificação dos complexos formados com corante específico.
IMUNOFIXAÇÃO
Eletroforese com imunofixação. SPE é a eletroforese de referência e, a seguir, cada
campo foi analisado com o anti-soro respectivo (anti-IgG, antiIgA, anti-IgM, anti-
kappa e anti-lambda). Notamos neste paciente a presença de proteína M monoclonal
em IgM-kappa. (Fonte: Testes Laboratoriais Aplicados à Imunologia Clínica)
IMUNOCROMATOGRAFIA
REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO
• Formação de agregados visíveis como resultado da interação
de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm
determinantes antigênicos em sua superfície.
• Pode ocorrer:
- partículas que apresentam determinantes antigênicos
naturais em sua superfície (hemácias, bactérias,
protozoários, etc.) � aglutinação direta;
- partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, etc.) �
aglutinação indireta.
• Diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus,
bactérias, protozoários e fungos, doenças auto-imunes, na
detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneosdetecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos
dos sistemas ABO e Rh, etc.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
• O antígeno faz parte naturalmente da célula, haverá
aglutinação destas células promovida por anticopos contra
estes antígenos;
• Células bacterianas também podem ser utilizadas como
antígeno para a pesquisa de anticorpos em amostras de soro
de pacientes, como por exemplo na leptospirose, brucelose e
salmonelose.
Anticorpo + Sangue
negativo positivo
Reação da ligação 
antígeno-anticorpo
Detecção da Samonelose por aglutinação
direta, utilizando soro do paciente.
AGLUTINAÇÃO INDIRETA
• Emprega a absorção de antígenos solúveis na superfície de
micropartículas inertes, sem interferir na interação antígeno-
anticorpo;
• Por exemplo: plásticos, gelatina, carvão e hemácias
formolizadas e taninizadas deaves e de carneiro;
• Permite a interação com proteínas e precipitação.
AGLUTINAÇÃO POR LÁTEX
• Partículas de látex (poliestireno) sofrem adsorção de Ag
polissacarídeos ou proteínas solúveis;
• Detecta IgG e IgM;
• Uso: diagnóstico da toxoplasmose, rotavírus, fator
+
• Uso: diagnóstico da toxoplasmose, rotavírus, fator
reumatóide (FR), proteína C reativa (PRC), Anti-estreptolisina
O (ASLO);
• Ag são adsorvidos na superfície da hemácia;
• Ag proteicos são adsorvidos através de tratamento com ácido
tânico;
• Utilizado para teste de Doença de Chagas e toxoplasmose.
Aglutinação ou Hemaglutinação Indireta 
Hemácias não ligadas a anticorpos ���� precipitação
Hemaglutinação Indireta para Toxoplasmose
Microplaca de Hemaglutinação, onde: as amostras 1,5,7,8,10 e 11
Reagentes, ou seja, apresentam anticorpos contra T. gondii e
amostras 2,3,4,6 e 9 Não reagentes; C- refere-se a controle
Negativo e c+ a controle Positivo
+
Soro anti - hCGUrina
São incubados e
Adicionam-se Partículas 
revestidas com hCG
Inibição da Aglutinação Passiva ou 
Indireta
Resultado negativo
(ausência de hCG na
urina):
-Ocorre aglutinação, pois
os anticorpos anti-hCG
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
São incubados e
colocados numa
placa
revestidas com hCG
Resultado positivo:
(presença de hCG 
na urina): não ocorre 
aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, 
(ficando bloqueados), na incubação inicial
os anticorpos anti-hCG
não são bloqueados na
incubação inicial, porque
não havia o hormônio na
urina;
-Livres, podem aglutinar
as partículas revestidas
de hCG.
• Reação semelhante a precipitação;
- Os imunocomplexos estão dissolvidos.
• Visualização através de lupa ou microscópio;
FLOCULAÇÃO OU MICROFLOCULAÇÃO
• VDRL (Veneral Disease Research Laboratory);
• RPR (Rapid Plasm Reagin);
- Sífilis;
FLOCULAÇÃO OU MICROFLOCULAÇÃO
• Produção de microfoculação
das reagininas IgG e IgM entre
as cardiolipinas (teste).
CONCEITOS BÁSICOS EM SOROLOGIA
• Anticorpos Policlonais;
• Anticorpos Monoclonais;
• Título;
• Teste de referência;
• Sensibilidade;
• Especificidade;• Especificidade;
• Falso-positivo e falso-negativo;
• Reação cruzada;
• Precisão;
• Acurácia ou exatidão;
• Reprodutibilidade;
• Limiar de reatividade (cut off).
• Os anticorpos séricos resultantes são heterogêneos, compreendendo
uma mistura de anticorpos, cada um específico para um epítopo;
• Resposta imunológica do anticorpo policlonal facilita a localização, a
fagocitose e lise do antígeno mediada pelo complemento, tendo
vantagens claras para o organismo in vivo;
ANTICORPOS POLICLONAIS
vantagens claras para o organismo in vivo;
• Etapas para produção:
- Purificação do antígeno para o qual queremos produzir um anticorpo;
- Imunização do animal com o antígeno de interesse por injeção;
- Coleta do sangue do animal após alguns dias e procedimento de
separação e purificação dos anticorpos produzidos.
ANTICORPOS MONOCLONAIS
• Pesquisa, diagnóstico e terapêuticos (derivam de um único clone,
sendo específicos para um único epitopo);
• Em 1975, Georges Köhler e Cesar Milstein desenvolveram um método
para a preparação de anticorpos monoclonais:
- Após imunizarem ratinhos com determinado antígeno, as células do
baço são coletadas;
- são selecionadas as células B normais (produtoras de anticorpos),- são selecionadas as células B normais (produtoras de anticorpos),
que são fundidas com uma célula de mieloma (plasmócito tumoral),
gerando uma célula híbrida (hibridoma);
- este hibridoma possui as propriedades de crescimento das células
imortais do mieloma e segrega o anticorpo produzido pela célula B em
grande quantidade e cultivados indefinidamente;
- seleção e sobrevivência das células híbridas;
• Os hibridomas que produzem anticorpos da especificidade
desejada são identificados e clonados para uma cultura de células
individuais.