Análise de Caso I - CRE recombinase lox71 e lox66

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Análise de Caso I - Microbiologia Molecular
Alunos: Camila Delaix, Laura Boose e Laura Hoefel
As questões abaixo foram confeccionadas com base no artigo disponível em https://doi.org/10.1128/mSphere .00710-19. Com base na análise das figuras associadas a cada questão, responda aos questionamentos: 
 
1 - Analise a figura abaixo e responda 
 
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A – o que é cura de plasmídeo? É fazer a eliminação dele após ele ter feito seu trabalho (passado pro DNA a região de interesse)
B – o que é CRE recombinase? Uma enzima capaz de fazer a recombinação dos sítios lox
C – Qual a razão de inserir dois sítios alvos de CRE? Para que ela possa reconhecer os sítios alvos em duas regiões e fazer a recombinação, eliminando genes nos cassetes de Lox. 
 
 2 – Considere a figura abaixo e responda com quais pares de primers os autores provaram que ocorre inserção de lox71 no gene cphy2944? Explique o racional deste experimento. 
 
	
Para inserção no lox71 eles utilizaram os pares 2944_1/2 e int_1/2. 
A lógica utilizada é de que, se lox71 não tivesse sido inserida, os primers 2944_1/2 amplificariam uma região menor (pois não teria todo o pedaço de lox71 dentro), seria apenas a região em cinza mostrada na figura. Por isso no WT temos bandas menores do que nos mutantes. 
Já para os primers int_1/2 são utilizados para uma confirmação num PCR inverso. Eles estão localizados juntos na região que será inserida com lox71, e por isso só serão amplificadas regiões nos mutantes (aqueles que contém a inserção). Como eles utilizam o mesmo par de primer para lox71 e lox66, vemos no gel da figura E duas bandas, sendo a de 3.5kb correspondente a lox71 e a de 1.3kb correspondente a lox66. 
 
3 – Explique o mecanismo proposto de ação de CRE na remoção da região flanqueada por sítios lox e como os autores comprovaram que esta deleção de fato ocorreu, com base na análise da figura abaixo: 
Como vimos pela imagem da figura anterior, os primers 2944.1 e 2993.2 são primers que ficam externos a região de deleção, e portanto se mantém. Já os primers 2944.2 e 2993.1 ficam internos e serão deletados. 
Como podemos ver no gel, a amplificação com os primers 2944_1/2 gera produtos apenas nas linhagens não transformadas com Cre (DI-SS e DI-AS) pertencentes a região do lox71. Já os primers 2993_1/2 analisam a região do lox66 e, da mesma forma, só geram produtos em DI-SS e DI-AS. 
Já as linhagens DEI-SS e DEI-AS são linhagens transformadas com Cre, e podemos ver que temos bandas no gel somente no que se refere a utilização dos primers 2944.1/2933.2 que como dito ficam externos e serão amplificados.