8 ELETROFORESE

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ELETROFORESE
 
As moléculas de interesse bioquímico apresentam cargas elétricas
 
 Grande parte das pesquisas atuais em biologia estuda aspectos ligados às proteínas e
aos ácidos nucléicos. Essas macromoléculas têm uma característica bastante importante:
apresentam várias regiões (grupamentos) com cargas elétricas.
As proteínas apresentam tanto grupamentos com cargas positivas quanto grupamentos
com cargas negativas, provenientes dos aminoácidos que as constituem. As cargas são
resultado da ligação ou perda de prótons. Os prótons (H+) são íons com carga positiva. Alguns
grupos são neutros e ao receberem um próton, tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH2,
que, ligando-se a prótons, é convertido a -NH3+). Outros grupos são neutros mas, ao perderem
um próton, tornam-se negativos (é o caso do grupo -COOH, que se converte em -COO-). Estas
perdas e adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra.
A somatória das cargas de todas as regiões carregadas de uma proteína confere uma
carga total à proteína. Como foi assinalado, essa carga total da proteína pode variar dependendo
do pH do meio.
Já os ácidos nucléicos (DNA e RNA) apresentam uma situação mais simples do que as proteínas
porque só apresentam as cargas negativas dos grupos fosfato. Outra característica interessante
dos ácidos nucléicos que surge de sua estrutura polimérica repetitiva é que a razão entre o
número de cargas negativas e o número de átomos que compõem o ácido nucléico é
praticamente constante, independentemente do tamanho ou da seqüência de nucleotídeos da
molécula.
 
As cargas elétricas migram quando submetidas a uma diferença de potencial elétrico
 
 Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença de
potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são conectados à
solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as cargas negativas, pelo pólo
positivo, deslocando-se em direção a eles. Os ácidos nucléicos, como são carregados
negativamente, migram em direção ao pólo positivo.
Essa migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é
chamada de eletroforese.
 
A eletroforese normalmente é realizada com suportes
 
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 Apesar de corresponder a uma migração de cargas em solução, a eletroforese não é
normalmente realizada em soluções “puras”. Isso porque as soluções estão sujeitas a uma série
de influências físicas do ambiente que lhes causam perturbações. Dentre as inúmeras fontes
dessas perturbações destacam-se as ondas mecânicas e até mesmo movimentos de convecção
do líquido pelo aquecimento da solução causado pela aplicação da diferença de potencial. As
perturbações fazem com que a eletroforese, nessas condições, seja um processo muito pouco
reprodutível, com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim, dispersas.
 Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturbações à
eletroforese são minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes rígidas - conhecidas como
suportes - com as quais a solução interage e que diminuem as perturbações mecânicas e os
movimentos de convecção no líquido. Existem dois tipos básicos de suportes: os suportes de
papel e os suportes de gel.
 Nos suportes de papel, a natureza hidrofílica da celulose faz com que se forme uma
película de líquido sobre o papel. Como a interação entre a fase aquosa e a celulose é intensa, a
solução sofre pouca influência de fatores mecânicos. Exemplos de suportes desse tipo são o
papel de filtro e o acetato de celulose.
 Já nos suportes de gel, a solução fica retida dentro dos poros da trama do polímero que
compõe o gel. Dessa forma, a solução também pode ser poupada de turbulências e convecções.
Exemplos de suportes desse tipo são os géis de agarose e poliacrilamida.
 
A velocidade de migração das cargas é influenciada por diversos fatores
 
 Vimos que vários fatores físicos, como choques mecânicos e alterações na temperatura,
podem afetar drasticamente a migração de cargas em solução. Esses fatores podem ser
contornados pelo uso de suportes para a eletroforese. Porém, outros fatores podem influenciar o
movimento das cargas, principalmente a velocidade de migração de macromoléculas, mesmo se
utilizamos suportes. Três fatores se destacam: a intensidade da diferença de potencial aplicada,
a carga total da macromolécula e o tamanho da macromolécula.
 A principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença de potencial.
Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, maior será a velocidade
com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.
 Por outro lado, se considerarmos a carga total da macromolécula, quanto maior for essa
carga, maior será a atração eletrostática da molécula pelo pólo de sinal oposto. Dessa forma,
quanto maior for a carga da macromolécula, maior será a sua velocidade de migração
eletroforética.
 O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade de
migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o solvente, o
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suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a macromolécula, menor a
sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal oposto.
 
A eletroforese pode ser usada para separar moléculas com carga
 
 Tendo em vista todos os fatores influentes sobre a migração eletroforética, consideremos
uma solução em que haja uma mistura de macromoléculas com tamanhos e/ou cargas
diferentes. Ao aplicarmos uma diferença de potencial a esta solução, as moléculas migrarão com
velocidades e/ou direções diferentes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Ao final de um
dado intervalo de tempo, ao desligarmos a fonte da diferença de potencial, cada tipo de molécula
estará em um lugar diferente da solução no espaço entre o pólo positivo e o pólo negativo.
 Essa potencialidade da eletroforese é usada para separar macromoléculas contidas
numa mistura complexa. Com efeito, a eletroforese encontra inúmeras aplicações tanto na
pesquisa e no desenvolvimento biotecnológico baseados na tecnologia do DNA recombinante
quanto nos diagnósticos clínico e forense, como veremos ao longo deste curso.
 Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das
macromoléculas, podemos separá-las mais com base na carga ou mais com base em seu
tamanho.
Na eletroforese em suporte de papel, a fricção com o suporte que as macromoléculas
experimentam é pequena, o que faz com que o tamanho da molécula não influencie
profundamente a sua velocidade de migração. Sendo assim, as moléculas são preferencialmente
separadas com base em suas cargas. Esse tipo de eletroforese encontra grande utilidade na
separação de proteínas que, devido à variada composição de seus aminoácidos, apresentam
grandes diferenças na carga total.
No entanto, a eletroforese em papel não é útil na separação de ácidos nucléicos. Como vimos
acima, a quantidade de cargas por massa molar de ácido nucléico é praticamente constante,
independentemente do tamanho ou da seqüência de nucleotídeos da molécula. Sendo assim,
todas as moléculas de ácido nucléico em uma solução sofreriam a mesma atração eletrostática
pelo pólo positivo. Mas, como o suporte de papel não apresenta grande capacidade de separar
moléculas com base no tamanho molecular, os diferentes fragmentos de ácido nucléico não
seriam separados nesse suporte.
Esse problema é resolvido nos suportes em gel.Nestes suportes, como a solução está
contida na trama do gel, a fricção entre as macromoléculas e o suporte é grande. Ou seja, os
suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as moléculas com base no tamanho
molar, sendo praticamente o único tipo de suporte para eletroforese utilizado para a separação
de fragmentos de ácidos nucléicos.
 
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Exercício 1:
Uma técnica muito u�lizada para a separação de fragmentos de ácidos nucleicos é a eletroforese em gel de agarose.
Sobre essa técnica é correto afirmar:
A)
a molécula de DNA é posi�va e, portanto, após aplicação de uma corrente elétrica ela migrará para o polo nega�vo.
B)
quanto maior a concentração do gel mais rapidamente migrará a molécula de DNA.
C)
a mesma molécula na forma circular migrará diferentemente da forma linear.
D)
quanto maior o tamanho do fragmento de DNA maior a carga total desse fragmento e, portanto, maior a sua
velocidade de migração.
E)
a força iônica não altera a migração do DNA no gel.
Comentários:
Essa disciplina não é ED ou você não o fez comentários 
Exercício 2:
Analise as afirma�vas a seguir.
I. A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de par�culas em um
determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial.
II. A eletroforese em gel é u�lizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
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III. Existem vários �pos de eletroforese em gel para analisar proteínas durante o processo de purificação. Entre elas,
estão a eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil de sódio sulfatado (SDS-PAGE), a eletroforese em gel
de poliacrilamida não desnaturante (Na�ve PAGE) e o gel em duas dimensões.
Assinale:
A)
se apenas a afirma�va I es�ver correta.
B)
se apenas as afirma�vas I e II es�verem corretas.
C)
se apenas a afirma�va II es�ver correta.
D)
se apenas a afirma�va III es�ver correta.
E)
se apenas as afirma�vas I e III es�verem corretas.
Comentários:
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Exercício 3:
Na análise proteômica empregando eletroforese bidimensional, a focalização isoelétrica é realizada para:
A)
separar as proteínas pelo peso molecular.
B)
agrupar as proteínas pela quan�dade total de cargas posi�vas.
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C)
separar as proteínas pela quan�dade total de cargas nega�vas.
D)
separar as proteínas de acordo com o pH onde a carga total de uma determinada proteína é nula.
E)
agrupar as proteínas de pI diferentes.
Comentários:
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Exercício 4:
A respeito de eletroforese, uma metodologia amplamente empregada para separação, isolamento, análise e
manipulação dos ácidos nucleicos, assinale a opção correta.
A)
A quan�ficação de DNA em gel de agarose é uma técnica de menor precisão, comparada a eletroforese em
acrilamida, sendo u�lizada como instrumento para averiguação de êxito na etapa de extração.
B)
A eletroforese em gel de agarose é usada para separar proteínas de tamanhos diferentes, que podem ser
detectadas por fluorescência.
C)
A iden�ficação dos fragmentos amplificados de DNA não pode ser realizada em gel de poliacrilamida.
D)
A eletroforese consiste na migração das par�culas de uma solução coloidal sob a influência de um campo magné�co
onde a polaridade nega�va atrai as moléculas.
E)
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Os ácidos nucleicos possuem uma carga geral total posi�va, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouço e,
consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, migram em direção ao ânodo.
Comentários:
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Exercício 5:
A respeito de eletroforese em gel, assinale a opção incorreta.
A)
Os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes. A técnica de
separação dos fragmentos de DNA mais u�lizada é a eletroforese através de géis de agarose.
B)
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pec�na) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria
como a gela�na. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos
poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel.
C)
Como o DNA é carregado posi�vamente, ele é atraído pelo eletrodo nega�vo. Entretanto, para chegar ao eletrodo
nega�vo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.
D)
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos
de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente
proporcional a log10 de seus pesos moleculares. É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com
base na sua razão de migração.
E)
Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de e�deo, que possui
afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se
localizar as bandas que correspondem ao DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a
par�r dos géis de agarose.
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