Cromatografia em camada delgada prática

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Cromatografia em camada delgada (CCD)
Consiste no sistema cromatográfico em que a separação dos
componentes de uma mistura ocorre através da migração diferencial
sobre uma fase estacionária composta por uma fina camada de
adsorvente aplicado sobre um suporte plano, o qual pode ser
constituído de diversos materiais tais como vidro, alumínio ou poliéster.
A fase móvel é constituída por diversas misturas de solventes e
permanece no interior de um recipiente ou cuba de material
transparente e inerte, geralmente vidro, permanecendo vedada, onde
se deposita a cromatoplaca em posição vertical sob uma atmosfera
saturada da fase móvel.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Na cromatografia em camada delgada CCD, uma superfície sólida (por exemplo,
vidro ou polímero inerte) suportando um sólido ou um líquido aderido a um sólido
(FE), e um líquido (FM), que a percorre por capilaridade, arrastando os solutos,
numa migração diferencial, por conta da diferença de propriedades dos solutos em
relação à FE (fase estacionária).
Cromatografia em camada delgada (CCD)
EQUIPAMENTOS E PROCEDIMENTOS: Os equipamentos utilizados para a cromatografia em
camada delgada consistem em: placa, cuba ou câmara de eluição, fase estacionária, fase móvel,
sistema revelador.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Fases estacionárias (adsorventes)
Sílica – É o adsorvente mais amplamente utilizado na CCD.
É um adsorvente amorfo e poroso.
É usado também na cromatografia em coluna; entretanto, a sílica utilizada em CCD é mais fina.
A sílica é preparada por espontânea polimerização e desidratação do ácido silícico.
As substâncias são adsorvidas pela sílica via ligação de hidrogênio e interação dipolo-dipolo.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Alumina – Depois da sílica, é o adsorvente mais utilizado.
As propriedades físicas da alumina são similares às da sílica em termos de tamanho de
partícula, diâmetro médio do poro e superfície.
São disponíveis comercialmente alumina ácida (pH 4,0 - 4,5), neutra (7,0 - 8,0) e básica
(9,0 - 10,0).
Assim como a sílica, a alumina separa os componentes das amostras por polaridade, por
meio de ligações de hidrogênio, interação ácido-base de Lewis ou interações dipolo-
dipolo.
A seletividade da alumina na CCD de adsorção é similar à sílica-gel, sendo a alumina um
adsorvente melhor que a sílica para a separação de substâncias ácidas lipofílicas.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
A alumina de caráter ácido atrai fortemente substâncias básicas,
enquanto a alumina de caráter básico atrai mais fortemente substâncias
ácidas.
A alumina retém substâncias aromáticas mais fortemente que a sílica-
gel.
É empregada na separação de vitaminas lipossolúveis, alcaloides, certos
antibióticos e hidrocarbonetos policíclicos.
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Celulose - A celulose é um polissacarídeo altamente polimerizado por monômeros de glicose.
A celulose é, portanto, adequada para a separação de substâncias hidrofílicas, tais como
carboidratos e aminoácidos.
Poliamida - Em contraste com a celulose, a poliamida é uma resina sintética.
Poliamidas são utilizadas para a separação de compostos polares que são capazes de interagir
com o grupo amida por ligações de hidrogênio devido à sua estrutura molecular.
Dentre elas estão aminoácidos e derivados, benzodiazepínicos, ácidos carboxílicos,
ciclodextrinas, ácidos graxos, flavonoides, conservantes e praguicidas.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Reveladores e métodos de detecção
Após o desenvolvimento da cromatografia e a evaporação dos solventes, passa-se
ao método de revelação das manchas que pode ser físico ou químico.
Como método físico, a luz ultravioleta (lâmpadas com emissão de radiação entre
254 e 366 nm) é comumente empregada no caso de substâncias que se tornam
fluorescentes quando excitadas por luz UV ou visível.
Os métodos químicos compreendem a utilização de reagentes cromógenos.
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Identificação;
A posição final de cada mancha é designada pelo Rf (fator de retenção).
Após a revelação da cromatoplaca, mede-se a distância atingida por cada mancha
a partir da origem.
Essa distância é uma fração da distância total percorrida pelo solvente na fase
estacionária.
Rf = (distância atingida pela mancha a partir da origem) / (distância percorrida
pelo solvente desde a origem)
Cromatografia em camada delgada (CCD)
A CCD é de fácil compreensão e execução, permite separações em breve espaço de tempo,
reprodutibilidade e baixo custo.
Trata-se de um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada
através da distribuição desses componentes entre duas, ou mais, fases que estão em contato
umas com as outras.
Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através da primeira.
Sob condições bem estabelecidas, um dado composto percorre sempre uma distância fixa em
relação à distância percorrida pelo solvente.
Essa relação é chamada de fator de retenção (Rf) e é expressa como:
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Os valores de Rf devem ser menores do que 1.
Quando este for igual à zero, conclui-se que a substância não se
deslocou, quando for igual à unidade, conclui-se que a mesma
se moveu junto com o solvente.
Para ambos os casos, a escolha do eluente não foi apropriada,
devendo-se procurar então um novo eluente.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Muitas das substâncias separadas por esse processo não são coloridas, a
cor pode ser desenvolvida momentaneamente (para determinados
compostos) por exposição do sistema à luz ultravioleta (fluorescência),
pode-se também converter tais substâncias incolores a derivados
coloridos quando o sistema é pulverizado com um reagente apropriado
(sulfato cérico, ninidrina, cloreto férrico, entre outros) ou expondo a
atmosfera saturada com I2.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Princípio da cromatografia em camada delgada:
Partição de um soluto entre duas fases (como na extração) sendo uma
estacionária e uma móvel; o equilíbrio é constantemente deslocado
pela fase móvel e os solutos são separados pelas diferenças de
mobilidade impregnada em placa de vidro ou alumínio.
fase móvel (solvente) movido pelo efeito capilar pela placa.
Preparo da Placa:
1.Linha horizontal cerca 1 cm da borda com LÁPIS
2.Preparo da câmera de revelação:
escolher béquer adequado com tampa de vidro de relógio;
colocar o solvente (altura ~0,5 cm), tampar o béquer e deixar equilibrar (15 min).
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3. Aplicar amostra dissolvida na linha da placa usando-se capilar: tocar rapidamente o
capilar com amostra (evitar manchas grandes); se for o caso fazer várias aplicações no 
mesmo ponto;
identificar as manchas com LÁPIS;
4.Efetuar o desenvolvimento (revelação) da placa na câmera:
colocar a placa (pinça) na câmera de desenvolvimento (sem tocar com dedo); solvente deve
ficar abaixo da linha da aplicação;
deixar solvente subir até 0,5 cm abaixo do limite da placa;
retirar a placa (pinça)
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5. Visualizar as manchas:
deixar secar a placa;
marcar as manchas coloridas (LÁPIS);
visualizar manchas com lâmpada UV ou outro Método de Visualização.
Calcular os valores de Rf.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Resultado da CCD: O valor de Rf
Rf: “ratio to front”
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O valor de Rf é um parâmetro físico da substância e pode ser utilizado
para a identificação caso se mantenha constante os seguintes
condições:
solvente ou mistura de solventes;
fase estacionária (silicagel ou óxido de alumínio);
condições ambientais (temperatura etc.)
espessura da camada e quantidade de amostra aplicada.
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Métodos de visualização da manchas:
1. Utilizando-se lâmpada UV (254 e 365 nm):
Visualiza substâncias fluorescentes (placa sem indicador) ou que seqüestram a
fluorescência (placa com indicador fluorescente).
• Utilizando-se câmarade iodo:
Iodo reage com muitos compostos orgânicos, formando complexos, e levando a
manchas amarelas até marrons.
• Métodos específicos para detecção de grupos funcionais (métodos destrutivos):
a) ácido sulfúrico concentrado e aquecimento (manchas pretas);
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b)nitrato de prata para visualizar haletos de alquila (manchas escuras de prata da
decomposição dos compostos de prata formados);
c)formação de 2,4-dinitrofenil hidrazonas a partir de compostos carbonílicos
(coloração amarela ou alaranjada);
d)cloreto férrico (FeCl3) leva a complexos coloridos com fenóis;
e)ácidos podem ser visualizados com indicadores de pH como verde de
bromocresol;
f)compostos facilmente oxidados podem ser visualizados com oxidantes
coloridos como CrO3 ou KMnO4;
g)detecção de aminas com p-dimetilamino-benzaldeído e de aminoácidos com ninidrina.
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Aplicação:
•Determinar o número de componentes de uma mistura;
•Determinar o solvente (ou mistura) ideal para efetuar separação em coluna 
cromatográfica;
•Monitorar a separação durante a cromatografia em coluna;
Cromatografia em camada delgada (CCD)
Referências:
BRASIL. Farmacopéia Brasileira. 6ª ed. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2019. 874 p. Disponível em: 
https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/farmacopeia/farmacopeia-brasileira. Acesso 24 de março de 2021.
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https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/farmacopeia/farmacopeia-brasileira