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Prof. Dr. Luiz Carlos
MATERIAL COMPLEMENTAR
Métodos Instrumentais 
de Análises
 A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os 
resultados obtidos são, diretamente, proporcionais à concentração do analito na 
amostra, dentro de um intervalo especificado (faixa de linearidade).
Linearidade e curva de calibração
Fonte: autoria própria.
 BPF (RDC 17 16/04/2010) cita que os medicamentos devem passar por análises que 
determinam a pureza e a impureza dos princípios ativos, determinados em bula, dentre 
outras análises que asseguram a qualidade.
 Os padrões empregados podem ser considerados como a substância que se pretende 
avaliar a qualidade (por meio de uma análise química ou instrumental), com um elevado grau 
de pureza e estabilidade, e que irão resultar em dados analíticos confiáveis
(estatisticamente). 
 São exemplares de fármacos, impurezas, produtos de degradação, reagentes bem 
caracterizados e cujo valor é aceito sem referência a outros 
padrões. 
 São considerados padrões de referência oficiais todos os que 
sejam adquiridos com a certificação de uma farmacopeia 
(USP, FB, BP, etc.).
Padrão de referência
 Substância de fácil obtenção, purificação, dessecação e conservação. 
 Apresenta estabilidade.
 Impurezas devem ser facilmente identificáveis em ensaios qualitativos conhecidos.
 Teor de impurezas não superior a 0,01 – 0,02%.
 Elevada solubilidade (alto Ks).
 Elevado peso molecular.
 Sólido.
 Possuir processos analíticos rigorosos e validados, documentados e assegurados.
Padrões primários
 Padrões de referência farmacopeicos e primários: USP, FB, BP, EP (padrão EDQM) e JP.
 Padrões de referência não farmacopeicos e primários: TRC, Clearsynth, LGC, TLC, PGS e
ChromaDex.
Sites:
 https://www.edqm.eu/en/ph-eur-reference-standards-orders-catalogue
 https://www.usp.org/reference-standards
 https://www.clearsynth.com/en/
Exemplos
Fonte: https://www.clearsynth.com/en/
Fonte: https://www.clearsynth.com/en/
 Obtidos de laboratórios não certificados e padronizados com o auxílio de um padrão de 
referência primário. 
 São considerados como padrão de trabalho. 
Apresentam:
 Metodologia básica de análise;
 Estudo de estabilidade;
 Não demandam de processos rigorosos de produção e controle.
Padrão secundário
Fonte: 
https://www.sigmaaldrich.com/analy
tical-chromatography/analytical-
standards/certified-
reference/pharmaceutical-
secondary/coa-updates.html
 Será obtida por meio de calibração por padronização interna ou externa, e resultará em 
uma expressão matemática.
 Padronização externa: serão definidas as concentrações do padrão de referência 
(substância que se pretende analisar – analito) a partir de diluições seriadas. A análise das 
diferentes concentrações do padrão resultarão em uma variação proporcional no resultado 
da análise (sinal analítico).
Faixa de linearidade
Fonte: http://bcortez.files.wordpress.com/2008/08/espectrofotometria-uv-vis-seg-sem.pdf. 
Autor: Bruno L. Cortez de Souza.
Padronização externa
 A absorbância é muito importante, porque ela é, diretamente, proporcional à
concentração (c) de espécies absorventes de luz na amostra.
Fonte: 
http://bcortez.files.wordpress.com/2008/08/espectrofotometria
-uv-vis-seg-sem.pdf. Autor: Bruno L. Cortez de Souza.
 É construído um gráfico (curva analítica ou curva de calibração) por meio da relação dos 
resultados obtidos nas análises (eixo y), com as concentrações utilizadas (eixo x).
 O ajuste da curva de calibração é feito por ferramentas estatísticas, onde o nível de 
significância deve ser de 5%. 
As duas variáveis (concentração do padrão e resposta da análise) são relacionadas por meio 
da equação da reta: 
y = a + b.x
Onde:
 y é a resposta medida de acordo com a finalidade do 
método;
 x é a concentração do padrão de referência.
 A qualidade da curva é avaliada por meio da determinação do coeficiente de correlação (r).
 O valor de “r” deve ser acima de 0,99.
 Significa que existe pouquíssima dispersão entre os valores obtidos e uma menor incerteza; 
além disso, o coeficiente angular (a) deve ser diferente de zero.
Avaliação da linearidade
Exemplo: dosagem de proteínas
Concentração Abs 660 nm
(g/L) Abs 1 Abs 2 Abs 3 Média
0,08 0,288 0,28 0,284 0,284
0,16 0,378 0,378 0,378 0,378
0,24 0,469 0,465 0,467 0,467
0,32 0,540 0,543 0,542 0,542
0,4 0,611 0,580 0,596 0,604
Fontes: autoria própria.
Padrão interno
Conc. Na, ppm INa ILi INa/ILi
0,10 0,11 86 0,001279
0,50 0,52 80 0,006500
1,00 1,8 128 0,014063
5,00 5,9 91 0,064835
10,00 9,5 73 0,130137
Amostra 4,4 95 0,046316
Fonte: autoria própria.
Fonte: autoria própria.
INTERVALO
A espectrofotometria é uma técnica regida por duas leis complementares que, uma vez unidas, 
dará origem à equação de Lambert-Beer (A = ε.b.c). Sabendo-se da importância desta 
equação para obtermos as informações a respeito de análises realizadas com este método 
instrumental, complete a tabela de resultados, a seguir, de forma a expressar os resultados 
obtidos para a absorbância e a concentração correspondentes:
Exercício 1
Parâmetro A
ε 
(L.mol-1.cm-1)
b 
(cm)
C 
(mol.L-1)
T 
(%)
Dados x 4800 2,0 y 46,8
Arredondando: A = 0,330
Resolução
3,44 x 10-5 mol.L-1 = c
Resolução
Efetuou-se uma análise espectrofotométrica empregando um comprimento de onda de 260 nm, 
utilizando uma curva de calibração para a obtenção da concentração de um fármaco. O analista 
teve o cuidado de estabelecer o branco adequado e optou por analisar a amostra utilizando a 
cubeta de vidro e a lâmpada de deutério. A respeito desta análise, podemos afirmar que:
a) O analista errou ao empregar a cubeta de vidro para tal comprimento de onda, pois se trata 
de uma radiação visível.
b) O analista errou ao empregar a cubeta de vidro para tal comprimento de onda, pois se trata 
de uma radiação do tipo ultravioleta.
c) O analista errou ao empregar a lâmpada de deutério, pois se trata de uma radiação do 
tipo ultravioleta.
d) O analista errou ao empregar a lâmpada de deutério, pois se 
trata de uma radiação do tipo visível.
e) O analista errou ao empregar o comprimento de onda de 
260 nm, pois está na faixa entre as radiações 
ultravioletas e visíveis.
Exercício 2
Análise  λ = 260 nm
Resolução
Fonte: https://estudodacor.wordpress.com/aspectos-fisicos/espectro-da-luz/espectro-2/
Espectrofotometria 
Resolução
UV Visível
Lâmpada de 
deutério
Lâmpada de 
W
Espectrofotometria 
Resolução
UV Visível
Cubeta
Quartzo
Cubeta
Vidro
Plástico
Quartzo
Efetuou-se uma análise espectrofotométrica empregando um comprimento de onda de 260 nm, 
utilizando uma curva de calibração para a obtenção da concentração de um fármaco. O analista 
teve o cuidado de estabelecer o branco adequado e optou por analisar a amostra utilizando a 
cubeta de vidro e a lâmpada de deutério. A respeito desta análise, podemos afirmar que:
a) O analista errou ao empregar a cubeta de vidro para tal comprimento de onda, pois se trata 
de uma radiação visível.
b) O analista errou ao empregar a cubeta de vidro para tal comprimento de onda, pois se trata 
de uma radiação do tipo ultravioleta.
c) O analista errou ao empregar a lâmpada de deutério, pois se trata de uma radiação do 
tipo ultravioleta.
d) O analista errou ao empregar a lâmpada de deutério, pois se 
trata de uma radiação do tipo visível.
e) O analista errou ao empregar o comprimento de onda de 
260 nm, pois está na faixa entre as radiações 
ultravioletas e visíveis.
Resposta
Um analista efetuou uma análise de varredura de comprimento de onda (l) visando definir a 
radiação a ser ajustada em um espectrofotômetro. Para tanto, ele preparou um padrão de 0,50 
mg/mL e analisou para a faixa visível o comportamento do analito, obtendo os dados a seguir:
Qual é o comprimento de onda a ser ajustado no aparelho?
Exercício 3
l (nm) A
400 0,121
420 0,234
460 0,256
5000,356
540 0,215
580 0,440
620 0,600
680 0,320
720 0,360
800 0,123
 DESVIO INSTRUMENTAL:
 A lei só é válida para a radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de 
onda (l).
Como minimizar o desvio?
 Escolher a região onde o  é constante na região selecionada (pico de absorção).
Resolução
Comprimento de onda Concentração
A
b
s
o
rb
â
n
c
ia
A
b
s
o
rb
â
n
c
ia
Fonte: SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, 
F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de 
Química Analítica. Tradução da 8ª ed
americana. São Paulo: Ed. Thomson, 2007. 
Um analista efetuou uma análise de varredura de comprimento de onda (l) visando definir a 
radiação a ser ajustada em um espectrofotômetro. Para tanto, ele preparou um padrão de 0,50 
mg/mL e analisou para a faixa visível o comportamento do analito, obtendo os dados a seguir:
Qual é o comprimento de onda a ser ajustado no aparelho?
Resposta
l (nm) A
400 0,121
420 0,234
460 0,256
500 0,356
540 0,215
580 0,440
620 0,600
680 0,320
720 0,360
800 0,123
Um analista efetuou uma análise de amostra de lipídeos totais (mg/dL), diluída 50 vezes em 
espectrofotômetro, empregando um comprimento de onda de 560 nm e obteve, como leitura, a 
absorbância de 0,350. Sabe-se que o método teve montada uma calibração que resultou na 
equação:
Y = 0,654.X + 0,02
Efetuando-se os cálculos devidos é possível observar que esta amostra:
a) Apresenta uma concentração de 0,25 mg/dL.
b) Apresenta uma concentração de 5,05 mg/dL.
c) Apresenta uma concentração de 1,98 mg/dL.
d) Apresenta uma concentração de 0,51 mg/dL.
e) Apresenta uma concentração de 25,2 mg/dL.
Exercício 4
Um analista efetuou uma análise de amostra de lipídeos totais (mg/dL), diluída 50 vezes em 
espectrofotômetro, empregando um comprimento de onda de 560 nm e obteve, como leitura, a 
absorbância de 0,350. Sabe-se que o método teve montada uma calibração que resultou na 
equação:
Y = 0,654.X + 0,02
0,350 = 0,654.X + 0,02 0,350 - 0,02 = 0,654.X
0,330 = 0,654.X
0,504 = X 
Resolução
Um analista efetuou uma análise de amostra de lipídeos totais (mg/dL), diluída 50 vezes em 
espectrofotômetro, empregando um comprimento de onda de 560 nm e obteve, como leitura, a 
absorbância de 0,350. Sabe-se que o método teve montada uma calibração que resultou na 
equação:
Y = 0,654.X + 0,02
Resolução
Um analista efetuou uma análise de amostra de lipídeos totais (mg/dL), diluída 50 vezes em 
espectrofotômetro, empregando um comprimento de onda de 560 nm e obteve, como leitura, a 
absorbância de 0,350. Sabe-se que o método teve montada uma calibração que resultou na 
equação:
Y = 0,654.X + 0,02
Efetuando-se os cálculos devidos é possível observar que esta amostra:
a) Apresenta uma concentração de 0,25 mg/dL.
b) Apresenta uma concentração de 5,05 mg/dL.
c) Apresenta uma concentração de 1,98 mg/dL.
d) Apresenta uma concentração de 0,51 mg/dL.
e) Apresenta uma concentração de 25,2 mg/dL.
Resposta
INTERVALO
Um analista efetuou uma análise para determinar o teor de vitamina B2 em amostras de 
suplementos alimentares. Para tanto, optou por empregar o método da adição de padrão, 
tendo utilizado uma alíquota de 2,0 mL de amostra, seguido de reagente colorimétrico, e 
diluição a 125 mL. Em uma segunda alíquota de 2,0 mL de amostra foi adicionado 10 mL de 
padrão de B2 (100 ng/mL), seguido de reagente colorimétrico, e diluição a 125 mL. Após 
efetuar as leituras no espectrofotômetro ajustado a 260 nm obteve-se a seguinte tabela:
Dado:
Determine a concentração de amostra.
Exercício 5
Alíquota A
1 0,350
2 0,568
Exemplo de análise pelo método de adição de padrão:
Resolução
Amostra 
sem 
padrão
Método analítico
(equipamento ou 
reação)
A
Sinal A (1)
Amostra 
com padrão Método analítico
(equipamento ou 
reação)
AP
Sinal AP
(2)
Um analista efetuou uma análise para determinar o teor de vitamina B2 em amostras de 
suplementos alimentares. Para tanto, optou por empregar o método da adição de padrão, 
tendo utilizado uma alíquota de 2,0 mL de amostra, seguido de reagente colorimétrico, e 
diluição a 125 mL. Em uma segunda alíquota de 2,0 mL de amostra foi adicionado 10 mL de 
padrão de B2 (100 ng/mL), seguido de reagente colorimétrico, e diluição a 125 mL. Após 
efetuar as leituras no espectrofotômetro ajustado a 260 nm obteve-se a seguinte tabela:
Resolução
Alíquota A
1 0,350
2 0,568
Resolução
Um analista efetuou uma análise para a dosagem de teor de proteínas totais em amostras de 
diferentes alimentos, apenas trocando as mesmas e mantendo o equipamento e a cubeta de 
plástico (os mesmos empregados durante a calibração do método). Ao efetuar a análise dos 
resultados, se observou que, empregando um comprimento de onda de 660 nm (pico de 
absorção), obteve-se os seguintes resultados:
PS: as cubetas foram descartadas a cada análise. 
Exercício 6
Amostra A
1 0,123
2 0,314
3 1,230
4 0,124
Analisando os resultados, podemos afirmar que ocorreu um problema de:
a) Equipamento, pois os resultados sugerem a variação no caminho óptico.
b) Cubeta, pois os resultados sugerem a utilização da cubeta de plástico durante a análise.
c) Calibração do método, pois as absorbâncias deveriam aumentar para cada nova amostra.
d) Branco, pois os valores deveriam ser semelhantes para as amostras.
e) Limitação da Lei de Lambert-Beer em uma das amostras.
Exercício 6
 Equipamentos diferentes levam à alteração no caminho óptico. 
 Todas as análises espectrofotométricas devem ser calibradas, tendo em mente a 
manutenção de um equipamento. 
 Portanto, ao se variar o equipamento, é necessário refazer o procedimento de calibração. 
 O enunciado indica que foram efetuadas as análises de amostras de diferentes alimentos, 
porém, em um mesmo equipamento. 
 Logo, não ocorreu a variação no caminho óptico.
Análise da alternativa “a”
Espectrofotometria 
Análise da alternativa “b”
UV Visível
Cubeta
Quartzo
Cubeta
Vidro
Plástico
Quartzo
 Durante os procedimentos de calibração do método espectrofotométrico, deverá ocorrer um 
aumento proporcional da absorbância (lido no aparelho) diante do aumento da concentração 
do padrão de referência da substância de interesse.
 A análise realizada foi para as amostras de diferentes alimentos, portanto, não fazem parte 
das análises da calibração do método. Por sinal, para que se efetue a análise de amostras, já 
se faz necessário que tenha se dado a calibração do método diante de manutenção do 
caminho óptico (equipamento e cubeta) e do comprimento de onda (l), referentes ao pico de 
absorção para a molécula de interesse.
Análise da alternativa “c”
 O branco corresponde à solução contendo todos os componentes previstos na amostra, que 
será analisada pelo método e na ausência da molécula de interesse.
 O método (ao ser realizado) necessita, inicialmente, que se elimine a interferência promovida 
pela absorção de energia, pelas outras moléculas que não estejam presentes na amostra e 
que não seriam o alvo da determinação. 
 Ao se efetuar a calibração do método, já é previsto a definição do branco, a ser empregado 
no início de toda e qualquer análise espectrofotométrica.
Análise da alternativa “d”
 O limite quantitativo para a Lei de Lambert-Beer é igual a absorbância 1,000. Valores 
superiores devem ser desconsiderados, pois promovem um desvio na proporcionalidade 
entre a absorbância e a concentração.
Análise da alternativa “e”
Amostra A
1 0,123
2 0,314
3 1,230
4 0,124
Fonte: autoria própria.
Analisando os resultados, podemos afirmar que ocorreu um problema de:
a) Equipamento, pois os resultados sugerem a variação no caminho óptico.
b) Cubeta, pois os resultados sugerem a utilização da cubeta de plástico durante a análise.
c) Calibração do método, pois as absorbâncias deveriam aumentar para cada nova amostra.
d) Branco, pois os valores deveriam ser semelhantes para as amostras.
e) Limitação da Lei de Lambert-Beerem uma das amostras.
Resposta
INTERVALO
Ao efetuar uma separação por CCD para a caracterização de fármacos deveriam ser 
observadas duas manchas cromatográficas. Entretanto, apenas uma mancha se mostrou 
visível ao final da corrida cromatográfica. Indique a alternativa que melhor resolveria esta 
situação, de forma a permitir a identificação das duas moléculas:
a) Trocar a placa por um material apolar, por ter maior afinidade química com o fármaco.
b) Trocar a fase móvel por hexano, como forma de aumentar a interação com a placa.
c) Aumentar a temperatura da corrida, como forma de acelerar a velocidade de deslocamento 
da molécula pela placa.
d) Efetuar a revelação por radiação IV (infravermelha), por se 
tratar de uma reação química que torna as manchas mais 
escurecidas por oxidação da placa.
e) Efetuar a revelação por luz UV, pois as manchas de 
moléculas de vários fármacos tornam-se visíveis, apenas 
quando expostas a este tipo de revelador físico.
Exercício 7
Resolução
Distância máxima 
percorrida pelo 
solvente
Eluente
Ponto indicando a 
distância percorrida 
pelo soluto, antes de ser 
adsorvido pela placa
Vapor saturado do solvente no interior da câmara impede que ocorra a evaporação do 
eluente da superfície da placa e auxilia no mecanismo de retenção pela placa. Os solventes 
são adsorvidos pela placa e ocorrerá a interação entre o soluto (amostra) e a placa de sílica.
Fonte: https://br.pinterest.com/pin/141652350754982182/
 A placa delgada é a fase estacionária deste processo cromatográfico, e é constituída de 
sílica-gel ou alumina, que, por sua vez, apresentam uma alta polaridade.
 O solvente começa a ser absorvido pela placa, dissolvendo os solutos na linha de base. 
Os compostos presentes, então, tendem a ser arrastados para o alto da placa, juntamente 
com o solvente.
 De acordo com a interação estabelecida entre o soluto e a placa, o tempo de retenção 
aumentará devido a uma forte adsorção que ocorrerá desta molécula de soluto na placa.
Resolução
Fonte: 
https://brasilescola.uol.
com.br/quimica/silicon
e-constituicao-
aplicacoes.htm
Resolução
Revelação da placa
Luz UVVapor de 
iodo
A maioria dos compostos 
orgânicos são incolores. Com 
base nisto, um processo de 
revelação deve ser realizado, 
para que se possa identificar 
as manchas correspondentes 
aos compostos presentes 
na(s) amostra(s).
Exemplos: Fontes: acervo pessoal.
Resolução
Ao efetuar uma separação por CCD para a caracterização de fármacos deveriam ser 
observadas duas manchas cromatográficas. Entretanto, apenas uma mancha se mostrou 
visível ao final da corrida cromatográfica. Indique a alternativa que melhor resolveria esta 
situação, de forma a permitir a identificação das duas moléculas:
a) Trocar a placa por um material apolar, por ter maior afinidade química com o fármaco.
b) Trocar a fase móvel por hexano, como forma de aumentar a interação com a placa.
c) Aumentar a temperatura da corrida, como forma de acelerar a velocidade de deslocamento 
da molécula pela placa.
d) Efetuar a revelação por radiação IV (infravermelha), por se 
tratar de uma reação química que torna as manchas mais 
escurecidas por oxidação da placa.
e) Efetuar a revelação por luz UV, pois as manchas de 
moléculas de vários fármacos tornam-se visíveis, apenas 
quando expostas a este tipo de revelador físico.
Resposta
A seguir, temos o cromatograma típico da separação de três tipos de tocoferóis de amora-preta 
(Rubus sp.), por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescência:
Exercício 8
Fonte: CHIM, 2008.
Analise os picos I, II e III, e faça a correlação deles com os três tipos de moléculas de tocoferol, 
mostradas a seguir: 
Exercício 8
Fonte: CHIM, 2008.
FASE NORMAL:
 Fase estacionária polar;
 Fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);
 Solutos neutros;
 ↑polaridade soluto, ↑tempo de retenção;
 Mecanismo retenção: adsorção.
FASE REVERSA (inverso):
 Fase estacionária apolar (C18);
 Fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);
 Solutos apolares, não iônicos;
 ↑polaridade fase móvel, ↑tempo de retenção;
 Mecanismo retenção: partição.
Resolução
 Molécula de maior polaridade (menor número de radicais e grupos polares), que deverá 
apresentar menor interação com a coluna de fase reversa e, portanto, apresentará menor 
tempo de retenção. 
Resolução
Fonte: CHIM, 2008.
Resolução
Maior interação
Fonte: CHIM, 2008.
Resolução
Menor interação
Fonte: CHIM, 2008.
Resposta
δ-tocoferol
γ-tocoferol
α-tocoferol
Fonte: CHIM, 2008.
ATÉ A PRÓXIMA!