MIA Relatório Análise em Espectofotômetro I

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CENTRO UNIVERSITÁRIO PLANALTO DO DISTRITO FEDERAL
UNIPLAN
CURSO DE FARMÁCIA
Tayná Magalhães Soares RA: 02410031795
ANÁLISE EM ESPECTROFOTÔMETRO I 
ESPECTRO DE ABSORÇÃO E ANÁLISE
 DE AMOSTRA DESCONHECIDA
BRASÍLIA - DF
14 de Setembro de 2018
Tayná Magalhães Soares RA: 02410031795
I ANÁLISE EM ESPECTROFOTÔMETRO I 
ESPECTRO DE ABSORÇÃO E ANÁLISE
 DE AMOSTRA DESCONHECIDA
Relatório de aula prática de n° 01 apresentado como requisito parcial para obtenção de aprovação na disciplina Métodos Instrumentais de Análise, do curso de Farmácia do Centro Universitário Planalto do Distrito Federal - UNIPLAN.
Prof Ms. Klecius R. S. Celestino
BRASÍLIA - DF
14 de setembro de 2018
SUMÁRIO
1.0	INTRODUÇÃO								 4 e 10
1.0- INTRODUÇÃO
Espectrofotometria de absorção no UV-Visivel (ou Análise colorimétrica por espectrofotômetro)
A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. 
Fundamentos
A luz de uma maneira geral é mais bem descrita como uma radiação eletromagnética em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes como a figura abaixo representa:
Onde:
O comprimento de onda (λ) é a distância em metros, de um pico ao outro da onda.
A frequência (v) é o grau de oscilação das ondas em função da velocidade da luz no vácuo, que é representada pela constante c (c=2,998×108m.s-1). De modo que:
λ . v = c
Espectro eletromagnético representando os comprimentos de onda correspondente a cada radiação
A técnica espectroscópica é baseada no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia.
O aumento de energia é representado pela condição de frequência de Bohr:
E = hv
Onde:
E :  é a energia que aumenta em função da frequência, e
h: é a constante de Planck  h=6,626×10-34J.s.
A espectrofotometria consiste em usar o espectro radiante para estudar as soluções biológicas e químicas. No procedimento básico, um feixe de energia atravessa a solução, e sua absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos componentes presentes. Para as análises espectrofotométricas, a faixa do espectro de radiação mais utilizada vai do ultravioleta (λ = 200 nm) até o infravermelho (λ = 1000 nm). A faixa do visível vai de 400 a 750 nm, onde os seres humanos experimentam uma gama de sensações visuais denominada cores.
A luz usada em espectrofotometria é chamada luz monocromática, pois é referente a um único comprimento de onda que é obtido através de um espectrofotômetro:
Figura 1: Esquema do Espectrofotômetro: A fonte de luz tem seu feixe focalizado pelo colimador (C) sobre um prisma de quartzo. A luz é decomposta em ultravioleta (UV), violeta (VI), azul (AZ), verde (VE), amarelo (AM), laranja (LA), vermelho (VR) e infravermelho (IV). Ume fenda seletora escolhe uma fina porção desse espectro como luz monocromática (luz MC). A luz MC passa através da cubeta que contém a solução, e parte é absorvida, parte transmitida. Uma fotocélula acoplada a um galvanômetro mede a luz transmitida. A diferença é a luz absorvida. O galvanômetro tem uma escala especial de 0,0 a 2,00, que indica leituras lineares (aritmeticamente proporcionais à absorção da luz). As fontes de luz para ultravioleta são geralmente lâmpadas de Hidrogênio, ou de Deutério. Para o visível e infravermelho, lâmpadas de tungstênio e irradiadores de cerâmica são usados. A decomposição da luz é feita, além de primas, por grades de difração. Um método simples de obter luz MC é usar filtros, que são pedaços de vidro colorido especiais, que deixam passar a luz da sua cor. A luz MC dos filtros é de qualidade inferior à dos primas e grades.
É possível obter comprimentos de onda que sejam específicos para certas substâncias através da construção de uma curva de absorção espectral (varredura); onde a substância em questão (aquela que se quer determinar) é colocada na cubeta, e os comprimentos de onda do UV até o IV vão sendo passados, e a absorção de cada faixa é medida. O comprimento de onda a ser ajustado no aparelho será aquele onde tiver ocorrido a maior absorbância, pois, em essência se trata do pico de absorção de energia pela molécula. Ex: Para a análise do teor de glicose deve-se ajustar o aparelho em 500 nm, pois, se trata da maior absorbância para esta molécula.
Como as moléculas de substâncias diferentes têm níveis moleculares de energia diferentes, ocorre que cada substância absorve a radiação de maneira peculiar. Uma vez conhecido o espectro de absorção de uma substância pode-se determinar também em que quantidade essa substância se apresenta em uma solução analisada. Isso é feito através da medida da intensidade de luz que atravessa a amostra.
Quando a luz incide sobre uma substância pode ocorrer reflexão, refração, espalhamento ou absorção pelo material.
O processo de absorção ocorre a nível molecular. A absorção da radiação se dá quando a energia que ela transporta é igual a diferença entre dois níveis de energia da molécula.
A = log Po/P = log 1/T = – log T
Ex: Ausência de absorção à P = Po à T = 1 à A = 0
90% de luz absorvida à 10% transmitida à P = Po/10 à A = 1
A = ε . b . c
A = absorbância (adimensional)
b = caminho ótico (cm)
c = concentração (mol. L -1)
ε = absortividade molar (mol-1 . L . cm -1) à característico de cada substância em cada λ
A lei de Lambert & Beer
A força vital da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece:
“A absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução de amostra.”
Ou:
Log(I/I0) = εcl
A = εcl
Onde:
A: é a absorbância,
ε: é o coeficiente de extinção molar
I: é o comprimento da cubeta
É possível, por simples comparação visual, determinar a concentração aproximada de uma solução colorida comparando-a com soluções do mesmo soluto que tenham concentrações conhecidas. Quando dispomos de aparelhos capazes de medir a intensidade da luz transmitida pelas soluções (fotocolorímetros ou espectrofotômetros) podemos determinar a concentração da solução desconhecida pela aplicação da lei de Lambert & Beer que correlaciona a intensidade da luz transmitida com a concentração do soluto na amostra.
Lei de Lambert – Quando a concentração da substância é constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico.
Lei de Beer – Quando o trajeto óptico é constante, a absorção depende da concentração.
Combinando as duas leis, Absorção é proporcional ao trajeto óptico e à concentração.
Abs = a.c.l
O que demonstra que a Absorbância (Abs) de uma solução é proporcional (relação linear) à concentração do soluto corado (c).
A partir da proporcionalidade entre absorbância e concentração é possível obter uma curva de calibração, ou seja, um gráfico relacionando a Abs e a Concentração da amostra.
Figura 2: Curva de Calibração para Método Enzimático (GOD-POD) de detecção de glicose.
R2 é chamado de coeficiente de determinação e junto ao coeficiente de correlação R é um indicativo da linearidade do método desenvolvido. Métodos devem ter linearidade alta, ou seja, próximas a 1,0000 para que possam ser utilizados em uma técnica espectrofotométrica. 
A equação da reta y=a.x + b permite a relação direta entre a absorbância (y) e a concentração presente na amostra (x). Assim:
Abs = a.[concentração] + b
Para o exemplo acima temos:
Abs = 0,3496.[glicose] – 0,0011
A partir da equação de reta é possível determinar o valor de concentração para qualquer amostra analisada no espectrofotômetro. Exemplo:
Amostra resultou em Abs = 0,356.
Pela equação: 0,356=0,3496x[glicose]-0,0011
0,356+0,0011 = 0,3496x[glicose] (troca de lado, mudando o sinal, para isolar [glicose])0,3571 = 0,3496 x [glicose]
0,3571/0,3496 = [glicose] (passa dividindo para isolar [glicose])
1,021 mg/mL = [glicose]
1.1 Objetivo:
Efetuar varredura de comprimento de onda no espectro visível para análise do alaranjado de metila por espectrofotometria. Determinar o comprimento de onda a ser empregado em uma análise espectrofotométrica do alaranjado de metila.
2.0- MATERIAIS E REAGENTES
	MATERIAIS
	QUANTIDADE (BANCADA)
	Papel milimetrado
	1 folha
	Água Destilada
	1 frasco (Pisseta)
	Alaranjado de Metila (4,0 mg.L-1)
	1 frasco (10 mL)
	Amostra com teor desconhecido de Alaranjado de Metila
(verificar o teor a ser utilizado com o professor sendo recomendado concentração entre 1 mg/L e 5 mg/L
	1 frasco (10 mL)
	Pipeta Automática 1000 L
	1 unidade
	Recipiente para descarte de líquido
	1 frasco
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Espectrofotômetro
	1 aparelho para cada 2 bancadas 
	Papel Absorvente
	1 unidade
	Cubeta de Quartzo ou Vidro
	1 unidades para cada aparelho
3.0- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Teste I (Determinação do Espectro de Absorção)
Preparou-se a substância ‘Alaranjado de metila’ a concentração 4,0 mg.L-1.
Ajustou-se o comprimento de onda no espectrofotômetro para = 440 nm.
Lavou-se a cubeta com água destilada a após absorveu-se o excesso de água com papel absorvente.
Adicionou-se água destilada à cubeta de acrílico até a marca indicada na mesma.
Zerar o aparelho (espectrofotômetro), utilizando-se da água destilada como ‘branco’.
Adicionou-se a solução de alaranjado de metila (4,0 mg.L-1) à cubeta de acrílico.
Anotou-se o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
Ajustou-se o aparelho para os comprimentos de onda indicados na tabela abaixo, executando varredura da mesma amostra em variados comprimentos de onda. Anotou-se todos os valores de absorbância respectivos à cada comprimentos de onda.
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda para análise de solução de alaranjado de metila 4,0 mg.L-1.
	(nm)
	A (nm)
	440
	0,229
	450
	0,226
	460
	0,159
	470
	0,057
	480
	-0,058
	490
	-0,139
	500
	-0,196
	520
	-0,222
Obteve-se para esta análise de solução de Alaranjado de Metila por espectrofotômetria, o pico de absorbância de nm. 
Observa-se abaixo os dados obtidos representados em gráfico:
Teste II (Determinação da Absorbância de Amostras de concentração desconhecida de Alaranjado de Metila)
Ajustou-se o comprimento de onda correspondente ao pico de absorção para o Alaranjado de Metila (Max) (Definido após análise dos resultados da Parte I).
Adicionou-se água destilada à cubeta até a marca indicadora.
Limpou-se a cubeta com papel absorvente.
Zerou-se o espectrofotômetro a um comprimento de onda de 440 nm (pico de absorbância indicado pelo teste I).
Adicionou-se a solução de alaranjado de metila (concentração desconhecida) à cubeta de acrílico.
Realizou-se varredura de absorbância da solução de concentração desconhecida no espectrofotômetro.
Chegou-se para tal em um resultado de ABS = 0,228nm 
5.0- CONCLUSÃO
O trabalho prático tornou possível um maior aprendizado do funcionamento do espectrofotômetro, além da preparação de soluções para leitura a partir de uma solução padrão, como também a leitura de uma mesma substância em variados comprimentos de onda, fazendo se possível construir gráfico onde se visualiza o pico de absorbância (teste I). 
Os resultados obtidos no teste I, permitiram a análise e comparação da absorbância em diferentes de onda, já o teste II possibilitou a leitura de uma substância desconhecida a um comprimento de onda x, diretamente relacionado ao pico de absorbância encontrado no primeiro teste.
6.0- REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
Dados recolhidos em experimentos realizados em laboratório, na aula de Métodos Instrumentais de Análise no dia 31 de agosto de 2018.
Espectrofotômetro. Disponível em: <https://littlebabsi.wordpress.com/2015/06/10/tutorial-como-usar-o-espectrofotometro-e-como-criar-uma-curva-de-calibracao-abs-no-excel/>. Acesso em: 12/09/2018
Harris, Daniel C.; Análise Química Quantitativa;tradução Carlos Alberto Riehl...[et al.].5.ed. LTC Editora, Rio de Janeiro:1999. cp.19,20,21.