TECNOLOGIA DO SÊMEN

Prévia do material em texto

Biotécnicas da Reprodução
 Tecnologia do Sêmen
Obtenção do sêmen 
· Métodos de colheita do sêmen
· Ejaculado sem perdas ou impurezas
· Viabilidade dos espermatozoides não alterada
· Saúde e libido dos doadores conservados
· Procedimento mais simples possível 
Excitação mêcanica do pênis ou masturbação 
· Cães/Suínos/Touros zebuínos
· Vantagens:
· Manutanção da qualidade 
· Desvantagens:
· Animais devem ser mansos
· Risco de contaminação
· Cães:
· Necessidade de fêmeas em cio
· Becker ou tubo + membrana
· Ejaculação intra-vaginal, em gotas (30 minutos)
· 1° fração: pré-espermática 0,25 – 2 ml, transparente – “fluído prostático”
· 2° fração: espermática 0,5 – 4 ml, branca e viscosa, rica em espermatozóide
· 3° fração: pós-espermática – 3 a 30 ml, aquosa= “fluído prostático”/ “lava” uretra. Neutraliza acidez vaginal. Propulsão dos espermatozóides no trato genital feminino
· Suínos:
· Necessita de fêmea ou manequim 
· Coleta em becker com gaze
· Ejaculação: intracervical (5-10 minutos)
· 1° fração: translúcida – líquido seminal e poucos espermatozóides “limpa” canal uretral
· 2° fração: esbranquiçada e opaca = rica em espermatozóide
· 3° fração: líquido gelatinoso (glândulas bulbouretrais) impede refluxo de sêmenapós cópula
· Bovinos: 
· Exige condicionamento – dificuldade de monta 
· Risco de contaminação e traumatismo
· Não utilizado
Massagem das ampolas dos ductos deferentes
· Bovinos/bubalinos/equinos
· Massagem por via retal
· Tempo viável: segundos a 10 minutos
· Ejaculação: 
· 1° fração: secreção das glêndulas acessorias 
· 2° fração: rica em espermatozóides
· Contenção do animal 
· Limpeza do reto
· Massagem antero-posterior
· Coleta sêmen – coloração leitosa
· Vantagens:
· Aproveita animais inutilizados para monta
· Exame da fertilidade a campo
· Aparelhagem simples e reduzida
· Não precisa de fêmea ou manequim
· Desvantagens:
· Necessita de conhecimento anatômico
· Lesões traumaticas por imperícia do operador
· Sêmen exposto a contaminações em colheita demorada
· Sêmen qualidade inferior da VA
· Após ejaculação animais urinam
Eletro-ejaculação
· Indução por corrente elétrica 
· Medula espinhal – 4ª vértebra lombar
· Gerador elétrico/Bateria portátil/Probe
· Aproveita animais: 
· Inutilizados para monta e/ou machucados
· Não treinados ou que recusam a vagina artificial
· Com baixo libido (zebuínos)
· Bovinos/ovinos/caprinos/felinos/animais selvagens/animais laboratório
· Suínos – pouco utilizado (gordura)
· Bubalinos e equinos – não indicado 
· Preparo do animal: pêlos do prepúcio aparados, região lavada e enxuta
· Início : estimulos rápidos, 200 mA ou 4 volts / 2-3 segundos
· Intensidae e tempo – gradativo, 300mA ou 6 volts/ 3 – 10 segundos
· Ejaculação = variável indivíduo 
· Vantagens: 
· Dispensa fêmea e manequim 
· Várias colheitas no mesmo dia (exame andrológico)
· Maior segurança ao técnico na colheita
· Desvantagens: 
· Aparelho alto custo
· Sêmen bastante diluído
· Não determina libido/estresse
· Cuidados
· Introdução da probe no reto 
· Local do estimulo (caudal=ereção/cranial=ejaculação)
· Combinação correta = ereção e depois ejaculação 
Camisa peniana
· Equinos
· Camisa de borracha no pênis em ereção 
· Não recomendado
· Desvantagens:
· Difícil aplicação
· Acidentes por queda ou ruptura do preservativo
· Sêmen contaminado por secreções penianas e urina
· Retirada da camisa tem dificuldade 
· Não apresenta vantagem 
Vagina artificial 
· Bovinos/bubalinos/equinos/caprinos/ovinos
· Vantagens: 
· Método de eleição 
· Melhores condições higiênicas 
· Avalia libido, monta e volume do ejaculado 
· Desvantagens: 
· Utiliza fêmea ou manequim 
· Boa área 
· Risco de acidentes físicos 
· Difícil em animais de baixo libido 
· Não condicionados e indóceis
· Adaptada para cada espécie
· Temperatura e pressão: variável entre espécie e indivíduo
· Estímulo: visual, olfatório e tátil
· Outros estímulos: troca de manequim, mudança de local do manequim, presença de outro macho, dar uma volta com o macho
· Fêmea contida e cauda presa
· Prepúcio pelos aparados, lavado e enxuto
Obs:
· Impotência Coeundi: é a incapacidade para a prática sexual
· Luz do túbulo seminífero: libera o espermatozóide
· Glândula bulbouretral: desenvolvida no suíno
· Ampola: dilatação do ducto deferente
· Ovinos: uretra exposta 
Esponja na cavidade vaginal 
· Equinos/bovinos/ovinos/caprinos
· Espoja no colo uterino
· Retirada da esponja 
· Lavagem em diluidores seminais
· Vantagem: 
· Necessita de pouco material
· Desvantagem: 
· Muitos espermatozóides retidos na esponja
· Lesões espermáticas ao espremer a esponja
Coletor vaginal
· Dispositivo borracha, vidro ou plástico 
· Forma e dimensões variáveis (espécie)
· Reveste parede vaginal antes da cópula
· Desvantagens:
· Demora na adaptação da fêmea 
· Possibilidade de queda
· Sêmen em contato com dispositivo
Obs:
· Quando o óvulo não foi liberado ainda, os espermatozóides esperam na cérvix
· Junção tubaria: capacitação acrossomica 
Número de colheitas por espécie 
· Touro: 2 vezes por dia, 2 dias por semana / exaustão=15
· Carneiro: várias vezes por dia/exaustão 10 
· Bode: similar ao carneiro, mas não ejaculam frequentemente/exaustão=7
· Cachaço: dias alternados/exaustão = 3
· Garanhão: dias alternados/ exaustão=3
· Cão: três em três dias
Avaliação do sêmen 
· Realizada imediatamente após a colheita 
· Caracteres macroscópicos: volume/cor/aspecto/odor
· Caracteres microscópicos: turbilhamento/motilidade/vigor/vivos e mortos/concentração/morfologia
· Caracteres químicos: pH
· Caracteres funcionais: testes funcionais 
Caracteres macroscópicos
Volume (mL)
· Variável entre espécies e indivíduos 
· Sem valor biológico – principalmente eletroejaculação 
· Aspermia: ausência de ejaculado 
· Obstrução vias ejaculadoras 
· Bovinos: 5-8 mL
· Búfalos: 2-8 ml
· Caprino: 0,5-1,5ml
· Ovino:0,5-3,0 ml
· Equino: 60-150 ml
· Suíno: 50-600 ml 
· Cão: 1,5-8 ml
· Gato: 0,4-0,8ml
Cor
· Branco ou amarelo-marfim: Bovino, caprino, ovino
· Branco ou marfim: bubalino
· Branco acizentado: equino, suíno, cão, gato 
· Vermelho-vivo: sangue, ferimento, inflamação
· Marrom/vermelho-tijolo: sangue antigo
· Lesão crônica
· Esverdeada: pus/infecção
· Amarelada: pus/urina
Obs: 
Pus -> piócitos -> bactérias
Aspecto ou aparência 
· Depende da concentração espermática
· Cremoso (leite condensado): caprino e ovino
· Leitoso: bovino e bubalino
· Aquoso: carnívoro, equino e suíno
· Aparência coagulada: infecção 
· Exceto suíno e equino: tampão 
Odor 
· Sui generis – “gema de ovo”
· Fosfato de espermina
· Bode: hircino (lecitinase e lisolecitinase)
· Glândulas de Schietzel: estão localizadas na base do chifre de caprinos machos e fêmeas. Essas glândulas segregam o líquido responsável pelo odor hircino característico da carne e do leite da espécie
· Urinoso ou cítrico – urina
· Pútrido – bactérias
Caracteres químicos
pH
· Pode ser medido com fita indicadora ou medidor elétrico 
· Básico: inflamação glândulas anexas / contaminação colheita 
· Ácido: alta concentração espermática (ácido láctico = frutose)
· Bovino/bubalinos: 6,4 – 7,8 
· Caprino/ovino: 5,9-7,3
· Suíno: 6,8-7,9
· Equino: 6,2-7,8
· Cão: 6,3-6,8
· Gato: 6-8
Caracteres microscópicos
Turbilhonamento
· É o movimento em massa dos espermatozóides em forma de ondas, cristais escuros
· Depende da motilidade + vigor + [ ] espermática 
· Gota em lâmina aquecida (37 a 40 °C) objetiva de 10x e aumento de 100x 
· Interpretação subjetiva, visual
· Presente: bovinos, bubalinos, caprinos e ovinos
· Ausente: equino, suíno e carnívoros
0 – Ausência de movimento de massa = ondas ausentes
1 – Pouquíssimo movimento = ondas ausentes
2 – Pouco movimento = ondas poucos visíveis 
3 – Movimento aumentado = ondas visíveis 
4 – Movimento acelerado = ondas rápidas e claras
5 – Acentuado movimento = ondas rápidas e escuras
Motilidade (%)
· Representa o número de espermatozóides móveis
· Movimento progressivo retilíneo
· Todas as espécies
· Anormal: movimento circular retrógrado, choque térmico, hipotonicidade
· Movimentos oscilatórios: espermatozóides velhos
· Ausência de movimento:hipertonicidade 
· Bovino/gato: 60%
· Bubalino/suíno/equino/cão: 70%
· Caprino/ovino: 80%
· Gota em lâmina + lamínula (37 a 40 °C)
· Objetiva de 20 ou 40 x
· Aumento de 200 ou 400 x 
· Interpretação subjetiva = visual
· Análise computadorizada de sêmen (CASA): reduz subjetividade. Visualizada, digitaliza e analisa. Informações do movimento individual e subpopulações
Vigor 
· Intensidade do movimento espermático
· Associado a motilidade 
· Gota lâmina + lamínula (37 – 40 °C)
· Objetiva de 20 ou 40 x
· Aumento de 200 ou 400 x 
· Interpretação subjetiva = visual
· Ruminantes/suíno/equino/cão/gato: 3
1 – Ausência de movimento/exclusivamente oscilatório
2 – Movimento lento 
3 – Movimento intermediário 
4 – Movimento progressivo retilíneo e muito rápido 
 Proporção vivos e mortos
· Coloração supre-vital
· Sêmen + corante (1:1) = esfregaço
· Corantes: eosina + nigrosina
· Vermelho congo/azul de bromofenol
· Espermatozóides vivos: membrana seletiva, corante não penetra, fica incolor ou parcialmente cordo 
· Espermatozóides mortos: membrana não seletiva, corante penetra, fica corado
Concentração
· Número de espermatozóides em milhões / mL (cm³) de sêmen (x10⁶ /mL)
· Associada ao volume, turbilhonamento, motilidade e vigor
· Câmera de Neubauer
· Objetiva 40, 100 ou 200x 
· Espectrofotômetro
· Solução: formol, água destilada, solução fisiológica
· Cálculo da concentração: 
n = espermatozoides contados, somatória dos 5 quadrados
5 = número de quadrados
200 = fator de diluição
10 = fator de profundidade da câmara
1000 = para a transformação para mL.
[ ]=nx5x10x200x1000
· Fator de diluição recomendado: 
· Bovino/bubalino: 1:200
· Ovino/caprino: 1:400
· Suíno: 1:100 ou 1:200
· Equino: 1:10 a 1:100
· Cão: 1:20 a 1:100
· Média de concentração:
· Bovino/bubalino: 350 – 2000x10⁶
· Equino: 100 – 300x10⁶
· Suíno: 180 – 300x10⁶
· Caprino: 200 – 500x10⁶
· Ovino: 100 – 300x10⁶
· Carnívoros: 20 – 300x10⁶
Morfologia
· Esfregaço corado 
· Defeitos de morfologia
· Microscópio – 100x
· Contados de 100 a 200 espermatozóides 
· Preparação úmida
· Defeitos de estrutura
· Sêmen + formol (lâmina/lanínula)
· Microscópio – 1000x
· Contados de 100 a 200 espermatozóides
· Avaliação automatizada da morfometria espermática (ASMA): esfregaço corados, comprimento e largura da cabeça, área do acrossomo e cabeça, elipticidade (comprimento/largura), elongação (comprimento – largura/comprimento + largura), rugosidade, regularidade.
· Espermatozóides normais: 
· Ovino/caprino: 80%
· Bovino/bubalino/equino/suíno/cão:70%
· Gato:60%
· Proporção:
· Defeitos maiores: <10%
· Defeitos menores: <20%
CLASSIFICAÇÃO DE BLOM – 1950
· Patologias Primárias: patologias que ocorrem durante o processo de espermatogênese. Anomalias intra gonadais (endógenas). Ex: cabeça piriforme, em raquete, estreita, pequena, grande, curta, anormal solta, normal com cauda muito enrolada, forma dupla, inserção abaxial, defeitos da PI, GCP
· Patologias Secundárias: ocorrem depois que o espermatozóide já está formado. Anomalias extra gonadais (endógenas). Ex: cabeça isolada normal, cauda dobrada, acrossomo destacado
· Patologias Terciárias: manipulações de origem exógenas. Manipulação em laboratório. Ex: cauda dobrada ou enrolada, enrolada na porção final
CLASSIFICAÇÃO DE BLOM – 1972
Defeitos maiores: qualquer anormalidade que tenha sido relacionada com infertilidade ou condição patológica do testículo ou do epidídimo.
Defeitos menores: também podem causar infertilidade, mas é menos provável, pode haver fertilização
Alterações do acrossoma e núcleo
· Interferem diretamente na fertilidade
· Acrossoma: enrugado, contorno defeituoso
· Destacado: envelhecimento/choque térmico/abstinência/manipulação inadequado/caráter hereditário
· “Knobbed sperm”: grânulo persistente porção anterior – caráter hereditário
· Núcleo/cabeça: “diadem sperm defect” (invaginação)
· “Pouch Formation”: (vesiculação)
· Degeneração testicular/caráter hereditário
Alterações do colo
· Defeitos de inserção 
· Degeneração ou hipoplasia testicular 
· Disfunção epididimária/imaturidade sexual 
Alterações da Peça intermediária e cauda
· “Cokscrew defect”: saca-rolhas
· Distribuição irregular mitocondrial: degeneração testicular, caráter hereditário 
· “Dag defect”: disfunção epididimária/aumento de Zn
· GCD, cauda dobrada, fortemente dobrada: disfunção epididimária
Nomenclatura da análise seminal