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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO Campus Parque Tecnológico Interdisciplinar em Ciência e tecnologia-Trajetória: Biotecnologia AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUAS E SUPERFÍCIES DE BEBEDOUROS DE PARQUES DE SÃO JOSÉ DOS CAMPOS LUCAS MATHEUS ALEIXO ORIENTADOR(A):ELISA ESPOSITO SÃO JOSÉ DOS CAMPOS JULHO DE 2021 1 Resumo A qualidade da água é uma questão de saúde pública e a segurança dos consumidores deve ser garantida através das especificações que determinam as condições favoráveis para consumo. Os parques públicos das cidades são uma ótima escolha para quem deseja ter uma vida saudável, ou para um lazer em família. Habitualmente nesses locais existem bebedouros para o consumo de água, e infelizmente, é um fator de fácil acesso para a transmissão de microrganismos patogênicos. É importante a análise de microbiotas patogênicas para identificação de doenças causadas por esses seres. Tornando assim, possível a identificação de gêneros ou espécies de bactérias de bebedouros públicos dos parques das cidades. Esse projeto de pesquisa tem como principal objetivo avaliar condições higiênico- sanitárias de águas e superfícies de bebedouros presentes no bebedouro do Parque da Cidade Roberto Burle Max localizado na região norte de São josé dos Campos e no bebedouro do Parque Santos Dumont localizado na região central de São josé dos Campos, tendo em vista, um informativo para que as pessoas conscientizem órgãos públicos para um saneamento adequado do local. As análises consistem em pesquisa de coliformes totais e termotolerantes pela Técnica do Número Mais Provável, presença ou ausência de Escherichia coli, contagem de bactérias heterotróficas, utilizando-se a técnica de plaqueamento em profundidade em agar padrão para contagem e quantificação de bolores e leveduras pela técnica de plaqueamento em superfície em agar Sabouraud. ABSTRACT Water quality is a public health issue and consumer safety must be guaranteed through specifications that determine favorable conditions for consumption. Public parks in cities are a great choice for those who want to have a healthy life, or for family leisure. Usually in these places there are drinking fountains for water consumption, and unfortunately, it is an easily accessible factor for the transmission of pathogenic microorganisms. It is important to analyze pathogenic microbiota to identify diseases caused by these beings. 2 This makes it possible to identify of genera or species of bacteria from public drinking fountains in city parks. This research project has as main objective to evaluate the hygienic-sanitary conditions of water and surfaces of drinking fountains present in the drinking fountain of Parque da Cidade Roberto Burle Max located in the northern region of São José dos Campos and in the drinking fountain of Parque Santos Dumont located in the central region of São Paulo. São José dos Campos, with a view to providing information for people to make public bodies aware of the proper sanitation of the place. The analyzes consist of search for total and thermotolerant coliforms by the Most Probable Number Technique, presence or absence of Escherichia coli, counting of heterotrophic bacteria, using the technique of deep plating in standard agar for counting and quantification of molds and yeasts by surface plating technique on Sabouraud agar. 3 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Esquema ilustrativo da coleta com swab em superfície..............................pg 09 Figura 2: Esquema ilustrativo da diluição em série das amostras de água...............pg 11 Figura 3: Técnica NMP para coliformes totais e termotolerantes...............................pg 11 Figura 4: Esquema do procedimento de análise para bactérias heterotróficas em águas..........................................................................................................................pg 12 Figura 5: Ilustração do processo realizado para análises presuntivas de coliformes totais e termotolerantes em superfície..................................................................................pg13 Figura 6: Técnica realizada para bactérias heterotróficas em superfície...................pg 14 Figura 7 : Procedimento de contagem de bolores e leveduras em superfície...........pg 15 4 Sumário 1. INTRODUÇÃO............................................................................................................05 2. OBJETIVOS................................................................................................................08 2.1 Objetivos Gerais.....................................................................................................08 2.2 Objetivos específicos.............................................................................................08 3. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................08 3.1 Coleta das amostras de água e da superfície do bebedouro..............................08 3.2 Análises Microbiológicas da Água .......................................................................09 3.2.1 Coliformes Totais e Termotolerantes................................................................09 3.2.2 Contagem de Bactérias Heterotróficas............................................................11 3.3 Análises Microbiológicas da Superfície do Bebedouro......................................12 3.3.1Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP)......................................................12 3.3.2 Contagem de Bactérias Heterotróficas..............................................................13 3.3.3 Contagem de Bolores e Leveduras....................................................................14 4. CRONOGRAMA.........................................................................................................15 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................16 BIBLIOGRAFIA ..............................................................................................................16 5 INTRODUÇÃO A água é um elemento indispensável para a vida na Terra, pois é o solvente universal da biosfera e permite que inúmeras reações ocorram na natureza e nos seres vivos1. A água denominada potável corresponde à água doce disponível para consumo humano, após adequação de suas propriedades físico-químicas e biológicas. Esta não deve apresentar alterações físico- químicas e biológicas fora do estabelecido pela legislação, além de mudanças das suas características físicas como cor, odor, sabor e material em suspensão(FERREIRA FS, 2017, BARROS FGN, 2008, OLIVEIRA EM, 2018. Fatos históricos mostram que algumas epidemias globais que atingiram a população humana estão relacionadas com a água contaminada por micro- organismos, causando doenças como a cólera e a enterocolite( OLIVEIRA AP., 2016). A qualidade da água tornou-se uma questão de saúde pública no final do século XIX e início do século XX, devido à compreensão entre a relação água contaminada e as doenças. As doenças transmitidas pela água são caracterizadas principalmente pela ingestão de microrganismos patogênicos de origem entérica, animal ou humana, transmitidos basicamente pela rota fecal-oral (BERTAGNOLLI, et al., 2003; SILVA, ARAÚJO, 2003; LIBÂNIO; CHERNICHARRO; NASCIMENTO, HELLER, 2005; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) revelam que 80 % das doenças nos países em desenvolvimento são causadas pela água contaminada. A contaminação microbiana dos principais sistemasurbanos tem o potencial de causar grandes surtos de doenças transmitidas pela água, portanto garantir a qualidade de tais sistemas é uma prioridade (FERNANDEZ; SANTOS, 2007; COELHO et al., 2007; WHO, 2008). A qualidade da água é de responsabilidade do estado e da nação, devendo o primeiro assegurar que seja feita a gestão adequada dos recursos hídricos, e o segundo de usar o recurso conscientemente. A garantia de segurança e de potabilidade da água depende do funcionamento adequado de diversas etapas no processo de abastecimento, que vão desde o tratamento até a distribuição e, caso alguma delas apresente falhas, pode desencadear um processo de contaminação (BRASIL, 2011). 6 Dentre os principais usos da água, o abastecimento público é o uso mais nobre devendo esta ser considerada potável, ou seja, devem atender aos parâmetros microbiológicos, físicos, químicos e radioativos definidos pela legislação vigente e não não oferecer riscos à saúde do consumidor (SPERLING, 1996; BRASIL, 2011). A Portaria n° 2.914, de 12 de dezembro de 2011, do Ministério da Saúde, estabelece como padrão de potabilidade, para a água destinada ao consumo humano, ausência de bactérias do grupo dos coliformes termotolerantes ou Escherichia coli. Já em relação às bactérias heterotróficas, recomenda-se que não ultrapasse o limite de 500 UFC/mL ( BRASIL, 2011). Há dois grupos de coliformes. Os coliformes totais são uma classe de bactérias que possui como principal característica a fermentação de lactose com produção de ácidos, aldeídos e gás a 35°C entre 24 e 48 horas. Essas bactérias incluem principalmente os gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. Os coliformes termotolerantes são bactérias de um subgrupo de coliformes totais que possuem a capacidade de fermentar lactose a 44-45°C em 24 e 48 horas, sendo importantes indicadores da qualidade higiênico-sanitária. A principal espécie desse grupo é a Escherichia coli (E. coli), encontrada na microbiota intestinal humana e de animais de sangue quente, sendo identificada como indicador de contaminação fecal e da presença de patógenos entéricos em água, e, consequentemente, é utilizada como indicador para avaliar e monitorar as condições sanitárias de água para consumo (SILVA, 2017, ZULPO, 2006, ALVES, 2018). A utilização de testes para a determinação de indicadores de contaminação fecal em água é a maneira mais sensível e específica de estimar a qualidade da água, em relação à higiene e cuidados primários à saúde. Os métodos mais utilizados são: a quantificação de coliformes totais e fecais, seguida da enumeração de bactérias heterotróficas totais (BOMFIM et al., 2007). A contagem de heterotróficos, também conhecida como contagem padrão em placas, é um procedimento que objetiva estimar o número de bactérias heterotróficas na água, particularmente como uma ferramenta para acompanhar as variações nas condições de processo, no caso das águas minerais, ou eficiência das diversas etapas 7 de tratamento, no caso de águas tratadas. Permite ainda verificar as condições higiênicas em diferentes pontos da rede de distribuição. Não diferencia tipos de bactérias, sendo mais utilizadas para se obter informações sobre a qualidade de produtos, práticas de manufatura, matérias-primas utilizadas, condições de processamento, manipulação e vida de prateleira. Não é um indicador de segurança, pois não está diretamente relacionado à presença de patógenos ou toxinas, mas dependendo da situação, pode ser útil na avaliação da qualidade, porque populações altas de bactérias podem indicar dficiências na sanitização ou falha no controle de processo ou dos ingredientes (SILVA, et al 2010). A análise microbiológica de amostras de água proveniente de bebedouros de parques públicos, assim como do próprio bebedouro, é de suma importância para a sociedade, pois permite comprovar se a fonte de consumo está dentro dos parâmetros estabelecidos pela legislação vigente e verificar a potabilidade da água, como medida de prevenção de possível ocorrência de surtos de doenças veiculadas pela água contaminada por micro-organismos. Os bebedouros também podem ser fontes de contaminação microbiana, pois geralmente há contato direto entre eles e pessoas com hábitos higiênicos inadequados, levando à contaminação cruzada, e se os mesmos não forem devidamente e periodicamente higienizados também podem contribuir na transmissão de doenças causadas pelo consumo de água(MATA, 2020). Dentro deste contexto, o objetivo desta pesquisa é avaliar a qualidade microbiológica da água de bebedouros, disponíveis em dois parques públicos localizadoem São José dos Campos- São Paulo, e as condições higiênico- sanitárias da superfície dos mesmos, utilizando técnicas microbiológicas, além de determinar, de acordo com os padrões de potabilidade estabelecidos pela legislação vigente, se o consumo da água disponibilizada neste parque pode oferecer riscos à saúde. Todos os bebedouros disponíveis nos parques públicos serão amostrados. Para a coleta das amostras, as mãos deverão ser previamente higienizadas e todas as coletas serão das torneiras do bebedouro, com algodão embebido em álcool 70%, e 8 aberta por 2 minutos para vazão da água acumulada na tubulação. A seguir, um volume correspondente a 400 ml de água, de cada um dos bebedouros,será coletado em frascos de coleta, com capacidade para 500 ml, esterilizados, identificados e contendo solução de tiossulfato de sódio a 0,1% para neutralizar o cloro residual presente na água. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais Analisar a microbiota presente nas águas e superfícies dos bebedouros dos parques Santos Dumont e parque da cidade Robert Burle Max localizados em São josé dos Campos. 2.2 Objetivos específicos • Identificar microrganismos presentes nos dois bebedouros. • Relacionar a presença desses microrganismos com o local. • Avaliar a presença de microrganismos patogênicos nas amostras. • As análises consistem em pesquisa de coliformes totais e termotolerantes pela técnica do número mais provável • Identificar presença ou ausência de Escherichia coli • contagem de bactérias heterotróficas, utilizando-se a técnica de plaqueamento em profundidade em agar padrão • contagem e quantificação de bolores e leveduras pela técnica de plaqueamento em superfície em agar Sabouraud. 3. MATERIAS E MÉTODOS 3.1. Coleta das amostras de água e da superfície do bebedouro 9 Para este estudo serão selecionados dois parques públicos (A e B) da cidade de São José dos Campos-SP que possuem bebedouros disponíveis para a população. A coleta de amostras da superfície dos bebedouros será realizada com o auxílio de swab estéril embebido em água peptonada 0,1 %, sendo as amostras limitadas por um gabarito de 100 cm2 (um quadrado de 10cm x 10cm ) para padronizar o espaço a ser realizado o esfregaço. Para tal, o swab foi inclinado a 30 graus e os esfregaços foram coletados em diferentes pontos da área limitada pelo gabarito, tanto na horizontal quanto na vertical e na diagonal do mesmo. A seguir, cada swab foi introduzido em um tubo de ensaio estéril e identificado com data, horário e local. Todas as amostras foram acondicionadas em caixa de isopor com gelo e transportadas imediatamente ao laboratório de microbiologia Para a coleta das amostras de água realizou-se a assepsia do local de saída da água com álcool 70 % e posterior escoamento da água por 3 minutos. Um volume de 500 mL de água foi coletado em um frasco previamente esterilizado com 0,5mL tiossulfato de sódio a 1,8 %. Estas amostras foram transportadas até o laboratório de lanálise em isopor refrigerado. Figura 1 – Esquema ilustrativo da coleta com swab em superfície. Fonte: Autor 3.2 Análises Microbiológicasda Água 3.2.1 Coliformes Totais e Termotolerantes Todos os procedimentos que serão utilizados estarão de acordo com a American Public Health Association (APHA), descrita no Compendium of Methodos for the Microbiological Examination of Foods( SILVA N, 2017). Coletar 4 pontos diferentes, sendo em direções diferentes e/ou em locais distintos Água pepitonada 0,1% 10 Para análise de coliformes totais e termotolerantes, será empregada a técnica do Número Mais Provável (NPM). A homogeneização da amostra da água coletada de cada local deve ser realizada a partir da agitação de cada frasco num arco de 30º, trinta vezes. A seguir, as amostras de água serão submetidas a três diluições sucessivas. A primeira diluição consistiu em pipetar 1,0 ml da amostra de água e transferir assepticamente o volume pipetado para um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de solução salina a 0,9% esterilizada (diluição 10-1). Na segunda diluição, deve ser transferido 1,0 ml da diluição 10-1 para um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de solução salina a 0,9% esterilizada (diluição 10-2). Na última diluição, 1,0 ml da diluição 10-2 será inoculado em um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de solução salina a 0,9% esterilizada (diluição 10-3). Para cada diluição da amostra, alíquotas serão inoculadas em séries de três tubos contendo 10 ml de caldo Lauril Sulfato Triptose em concentração dupla, três tubos contendo 9,0 ml de caldo Lauril Sulfato Triptose em concentração simples e três tubos contendo 9,9 ml de caldo Lauril Sulfato Triptose em concentração simples, respectivamente com 10 ml, 1 ml e 0,1 ml da amostra (teste presuntivo). Todos os tubos contendo o meio de cultura apresentavam tubos de Durham invertidos. Após homogeneização, estes foram incubados a 35ºC por 48 horas. Os tubos de ensaios positivos para a presença de coliformes (turvação e formação de gás no interior do tubo de Durham) serão selecionados para realização do teste confirmativo para pesquisa de coliformes totais em tubos de ensaio contendo Caldo Bile Verde Brilhante (VB) a 2%, com tubo de Durhan invertido, e incubação a 35°C por 48 horas. Paralelamente, realizará o teste confirmativo para coliformes termotolerantes em tubos de ensaio contendo Caldo Escherichia coli (EC), com tubo de Durhan invertido, e incubação em banho-maria a 44ºC por 48 horas. Em ambos os testes, uma alçada do conteúdo do tubo positivo deve ser transferida para um tubo correspondente contendo o meio adequado à análise. Os testes serão considerados positivos quando apresentarem turvação do meio e produção de gás. Para os testes presuntivos negativos, com a ausência de produção de gás durante o período de incubação, a investigação será finalizada nessa fase e o resultado interpretado como negativo. 11 Figura 2 – Esquema ilustrativo da diluição em série das amostras de água. Fonte: Autor FIGURA 3 – Técnica NMP para coliformes totais e termotolerantes 3.2.2 Contagem de Bactérias Heterotróficas 1 mL de amostra + 9,0 ml de solução salina a 0,9% 1 mL de solução 10-1 9,0 ml de solução salina a 0,9% Solução a 10-1 Solução a 10 -2 Solução a 10-3 1 mL de solução 10-2 9,0 ml de solução salina a 0,9% 12 As amostras de água deverão ser diluídas em 9 mL de salina 0,9 % até 10-3. Após será utilizado a técnica de semeadura em profundidade, transferindo-se 1 mL de cada diluição para placas de petri estéreis, seguidos com 20 mL de ágar PCA (Plate Count Agar) e incubadas a 35-37°C por 24horas. O procedimento deverá ser realizado em duplicata. FIGURA 4 – Esquema do procedimento de análise para bactérias heterotróficas em águas 3.3 Análises Microbiológicas da Superfície do Bebedouro 3.3.1Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP) A análise de Coliformes Totais e Termotolerantes serão efetuadas conforme descrito na figura 5. Para tanto, devem ser retirados 1 mL de amostra após o procedimento de coleta descrita no item 2.1 e colocados em tubos contendo caldo LST que foram incubados à 35-37 °C durante 24-48 horas após inoculação da amostra e então verificaremos o possível crescimento (turvação e gás) nestes tubos. 13 FIGURA 5 – Ilustração do processo realizado para análises presuntivas de coliformes totais e termotolerantes em superfície. 3.3.2. Contagem de Bactérias Heterotróficas A contagem de bactérias heterotróficas deve ser procedida conforme descrito na figura 6. Após o procedimento de coleta descrito no item 2.1, as amostras foram diluídas em 9 mL de salina 0,9 % até 10-3. A técnica será realizada pelo método Pour plate, semeadura em profundidade. Para tanto serão retiradas alíquotas de 1 mL de amostra não diluída e também de cada uma das diluições e colocados em placas de petri estéreis nas quais serão vertidos 20mL de ágar PCA. O cálculo será expresso em unidades formadoras de colônias por 100 cm². 14 FIGURA 6 – Técnica realizada para bactérias heterotróficas em superfície 3.3.3 Contagem de Bolores e Leveduras A contagem de bolores e leveduras deverá ser realizada de acordo com o esquema apresentado na figura 7. Para tanto serão retirados 1 mL de amostra após o procedimento de coleta descrito no item 2.1 e colocados em placas contendo 20mL de ágar Sabouraud pelo método de semeadura em superfície (Spread plate), no qual as amostras deverão espalhadas sobre este ágar com auxílio de uma alça de plástico estéril. 15 FIGURA 7 : Procedimento de contagem de bolores e leveduras em superfície 5. CRONOGRAMA MES/ETAPAS Nov/2021 Dez/2021 Jan/2022 fev/2022 mar/2022 abr/2022 Escolha do tema X Levantamento bibliográfico X X X x Elaboração do anteprojeto X x Apresentação do projeto x Coleta de dados X X Análise dos dados X X X Elaboração de protocolos X X x Redação do trabalho X X X Revisão e redação final X X 16 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Com base nos resultados que iremos obter poderemos estabelecer se os bebedouros se encontram em condições sanitárias e higiênicas adequadas para consumo, sem trazer riscos à saúde humana. A positividade das amostras da água e da superfície dos bebedouros analisadas para coliformes totais indica a presença de matéria orgânica, presumindo-se que a superfície dos bebedouros não está sendo higienizada corretamente ou está sendo higienizada sem a periodicidade necessária, e consequentemente ocorre a contaminação da água. Os bebedouros podem ser considerados fontes diretas de contaminação através da água e indiretas através do contato das pessoas com o equipamento. Além de estarem expostos ao ambiente ou instalados no interior de sanitários, falhas na sua higienização e hábitos higiênicos inadequados na sua utilização contribuem para a contaminação microbiológica e os riscos à saúde, ao adquirir alguma doença infecciosa. Desta forma, se fazem necessários alguns cuidados, como, por exemplo, a constante manutenção e higienização dos bebedouros. BIBLIOGRAFIA ALVES SGS, ATAIDE CDG, SILVA JX. Análise Microbiológica de coliformes totais e termotolerantes em água de bebedouros de um parque público de Brasília, Distrito Federal. Rev. Cient. Sena Aires. [periódico online]. 2018 7(1): 12-17. Disponível em: http://revistafacesa.senaaires.com.br/index.php/revisa/article/view/298. [acesso em 11 de fev. 022]; BARROS FGN, AMIN MM. Água: um bem econômico de valor para o Brasil e o mundo. Revista Brasileira de Gestão e Desenvolvimento Regional [periódico online]. 2008 4(1): 75-108. Disponível em: http://www.rbgdr.net/012008/artigo4.pdf. [acesso em 10 fev. 2022]; BERTAGNOLLI, S. M. M.; MEDEIROS, J. T.; TAVARES, G. M. D. ; LIMBERGER, J. B.; TRAESEL, A. C. Estudo decoliformes totais de fontes alternativas de água da zona rural da região centro do estado do Rio Grande do Sul. Saúde , 29 (1) : 97-102, 2003. BOMFIM, M. V. 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